EHUko GENOMIKA ZERBITZU OROKORRA GENE ADIERAZPEN UNITATEA

1. Gene Adierazpen Unitatearen zerbitzuak eskatzeko, lehenik eta behin, Unitateko teknikariekin harremanetan jarri behar da zerbitzu mota, aztertu beharreko lagin mota eta kopurua jakinarazteko.
2. Kanpoko erabiltzaileen kasuan, arduradunak aurrekontuaren onarpena sinatua bidali behar du, zerbitzuaren eskaera egin aurretik. Barneko erabiltzaileen kasuan (EHU) RNA-ren erauzketaren zerbitzuentzat, Q-PCR eta microarrays zerbitzuetan bakarrik aurrekontuaren onarpenaren sinadura eskatzen du. Fakturazioaren datuak bidali behar dituzte zerbitzuaren egitearen onarpenerako.
3. Behin Gene Adierazpen Unitatearen teknikariaren aldetik zerbitzuaren onarpena baieztatua dela, erabiltzaileak dena delako zerbitzuari dagokion eskaera-inprimakia beteko du, eta aztertu beharreko laginekin batera aurkeztuko du. Laginak banakako eppendorf hoditan eramando dira eta bakoitzari etiketa bat jarriko zaio laginaren izenarekin; etiketak bat etorriko dira inprimakian jarritako datuekin. RNAko laginei dagokienez, karbono-elurretan izoztuta eramatea ezinbestekoa da. Azterketa bakoitzerako erabiliko diren laginak bidaltzeari buruzko informazio xeheagoa eskuratzeko Laginen baldintzak eta Eskainitako zerbitzuak atalera sar zaitez. Postaz edo mezularien bidez (SEUR, NACEX, etabar) bialdutako laginei dagokionez Teknikariek laginak jaso direla posta elektronikoz jakinaraziko diote erabiltzaileari.
4. CGH, CNV, ChIP-on-chip, mikroRNAs edo Exoi Mikroarray zerbitzuak eskatzeko jarri harremanetan Unitateko teknikariekin.
5. Esperimentua amaitu ondoren, Gene Adierazpen Unitateak horren berri emango dio erabiltzaileari eta emaitzak posta elektronikoz, DVD edo CDan edo posta arruntaz bidaliko dizkio. Emaitzak emateko epea eskatutako azterketa motaren arabera zehaztuko da; hain zuzen ere, 24tik 48 ordu bitartekoa izango da 2100 Bioanalyzer zerbitzuan, 3 egunetik 3 aste tartera PCR denbora errealean erako azterketetan, eta 4tik 6 aste bitartekoa Mikroarray zerbitzuan. Informazio gehiagorako sartu eskatutako zerbitzuaren atalean.
6. Onartutako aurrekontuaren aldaketaren kasuan, emaitzak eman ondoren, Unitateak erabiltzaileari egindako zerbitzua zehazten duen aurrekontu bat bialduko dio. SGIkerrek fakturatuko du zerbitzua. 2100 Bioanalyzerrekin analisiaren kasuan, zuzenean fakturatuko .
7. Zerbitzuak amaitu eta emaitzak ematen direnean, erabiltzaileak bidalitako laginak eta hasleak eta zundak, gehienez, bi hilabetez gordeko dira. Teknikaria erabiltzailearekin kontaktuan jarriko da laginen garbiketa egin aurretik.

Laginak bidaltzeko gomendioak

Laginekin batera zerbitzuaren eskaera-orria bidali beharko da, behar bezala beteta. Microarray proiektuei dagokienez, garrantzitsua da proiektuaren gainean ahal bezain beste informazioa bidaltzea.
Laginak 1,5 ml-ko hodietan bidaliko dira, eskaera-orrian laginari jarritako izen berarekin. RNasarik gabeko edo DEPCren bidez tratatutako uretan disolbatua egongo da. ARNko laginak elur karbonikoan edo izotz lehorrean izoztuta bidali behar dira. cDNAri dagokionez, izoztuta bidaltzea gomendatzen dugu.

Behar diren kopuruak

• 2100 Bioanalyzer:

RNA 6000 Nano Chips-erako, ARN osoaren laginen 2 ul bidali behar dira 25-500 ng/ul-ko kontzentraziora, eta, berriz, mARN laginen  2 ul 25-250 ng/ul-ko kontzentrazioan.

• Q-PCR zerbitzua:

cDNA laginen 1 ul migratzen da erreakzio bakoitzeko, eta laginak hirukoizki migratzen dira. Bidali erreakzio guztietarako beharko den lagina, hots: 3 x analizatu beharreko gene kopurua. cDNA-k 10-100 ng/ul-ko kontzentrazioa izango du (gutxi gorabehera, ARNko kontzentrazioak gidatuta). Sybr Green-ari dagokionez, kurba estandar bat egin behar da lagin-patroi baten 5 diluzio punturen bidez; ahal izanez gero, analizatuko diren laginen ehun bera eta erauzteka mota bera erabiliko dira. Kontzentrazioa 50 ng/ul baino handiagoa izango da.
cDNAren sintesirako erabilitako ARN kalitatezko gutxieneko baldintzak: A260/280 ≥ 1,8; RIN: 7.
2100 BIOANALYZERAREN BIDEZ ARN KALITATEAREN AZTERKETA GOMENDATZEN DUGU. RIN minimoa: 7.

SYBR Green-aren kasuan eta anplikoia exon desberdinetan diseinatuta egon ezean (exon bakarreko geneak), lagina DNasarekin tratatzea eta RT minuse-ko lagin bat bidaltzea (cDNA erreakzioa RT entzimarik gehitu gabe) gomendatzen da, DNA genomikoko kutsadurarik dagoen frogatzeko eta anplikoi ez-espezifiko bat emango lukeen jakiteko.

• Microarray zerbitzua.

       -Gene-adierazpena:
4x eta 8x neurriko microarrayak: ARN osoaren 200 ng, kontzentrazio gutxien  50 ng/ul eta RNasarik gabeko ur aratzean disolbatuta.
2x eta 1x neurriko microarrayak: ARN osoaren 400 ng, kontzentrazio gutxien  100 ng/ul eta RNasarik gabeko ur aratzean disolbatuta.
Laginak behar bezala identifikatuta bidaliko dira, 1.5 ml-ko eppendorf hobietan eta izotz lehorrean izoztuta. Kalitatezko gutxieneko baldintzak: A260/280 ≥ 1,8; RIN: 7.

• miRNAs

ARN osoaren 400 ng (ez erabili zutabeen bidezko purifikazioa ARNren erauzketan) kontzentrazio gutxien  100 ng/ul eta RNasarik gabeko ur aratzean disolbatuta.

• CGH/CNV

8x neurriko microarrayak: ADNren 1 ug , kontzentrazio gutxien  100 ng/ul, eta ur aratzean disolbatuta.
4x, 2x eta 1x neurriko microarrayak: ADNren 2 ug , kontzentrazio gutxien  100 ng/ul,  eta ur aratzean disolbatuta.

Lagin guztiak agarosazko gel batean migratu behar dira, ADNren integritatea zihurtatzeko. Gelaren argazkia laginekin batera eskuratu.
Kalitatezko gutxieneko baldintzak: A260/280 ≥ 1,7; A260/230 ≥ 1,5

OHARRA: Laginen aurreko baldintzak betetzen ez diren kasuetan zerbitzuko teknikariarekin kontaktuan jarri.

ARN eta ADN erauzketarako eta cDNAren sintesirako gomendatutako metodoak

ARN erauzketa

• Microarray analisirako:

       -Ehunetatik isolatzeko, erauzketa organikoko eta ondoren zutabe bidezko arazketa konbinazio bat gomendatzen dugu: RiboPure kit (AMBION).
       -Zeluletatik isolatzeko, erauzketa organikoa (TRI Reagent, AMBION; Trizol Reagent, Invitrogen) edo zutabe bidezko arazketa nahikoa da (RNAqueous kit, AMBION).

• Q-PCR

       -Ehunetatik isolatzeko, erauzketa organikoa (TRI Reagent, AMBION; Trizol Reagent, Invitrogen)
       -Zeluletatik isolatzeko, erauzketa organikoa (TRI Reagent, AMBION; Trizol Reagent, Invitrogen) edo zutabe bidezko arazketa nahikoa da (RNAqueous kit, AMBION).

• ARN lagin kopuru txikietatik ateratzeko, esate baterako, laser bidezko mikrodisekzioan lortutako laginetatik, PCR denbora errealean erabiltzeko baliozkotu diren bi metodo hauek gomendatzen dira: Stratagene-ren Absolutely RNA Nanoprep kita; eta AMBIONen RNAqueous Mikro kita.
• Agilent Technologies plataformako miRNA microarray sistemaren bidez MikroARNa (miRNA) analizatzeko erabiliko den ARNa ateratzeko, Agilent Technologies-ek hiru metodo hauek gomendatzen ditu: OIAGENen miRNeasy Mini kita , AMBIONen mirVana RNA isolation kita, eta Invitrogen-en Trizol Reagent edo TRI Reagent (AMBION). ARN osoa (ez miRNAean aberaztua) ateratzeko, Agilent-ek ekoizlearen argibideei jarraitzea gomendatzen du.

DNA ateratzea Agilent Technologies-en CGH edo CNVko microarray sistemarako:

• Silize mintzen zutabeen bidezko metodoak gomendatzen dira: (adibidez QIAmp DNA blood extraction kit eta QIAmp DNA mini kit, QIAGEN). Agilent Technologies-ek OIAGENen DNeasy Blood & Tissue kita gomendatzen du.
• Finkatutako eta parafinatutako (FFPE) laginetatik DNA genomikoa ateratzeko Unitateko teknikariarekin kontsultatu.

ARN osotik cDNAren sintesia egiteko metodoak, PCR denbora errealean gene-adierazpena aztertu ahal izateko.

• Random primer-en erabiliera gomendatzen da.
• Unitateak arrakastaz baliozkotu ditu cDNA sintesia egiteko hiru kit hauek: Applied Biosystems-en High-capacity cDNA Reverse Transcription kit with RNAse Inhibitor; Applied Biosystems-en High-capacity RNA-to-cDNA Master Mix eta Invitrogen-en  SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR.

ARN laginen kalitate-baldintzak

PCR denbora errealean eta microarrays teknologien bidez eginiko analisietan arrakasta izateko erabakigarria da ARNko laginen kalitatea. ARNaren kalitatea oinarrizko hiru parametro hauen arabera neurtzen da:

• Araztasuna: laginak ezpurutasun organikoen eta ez-organikoen (adb: fenola, kloroformoa) edo proteinez bidez kutsatzeak eragin nabarmena du emaitzen zehaztasunean eta sentikortasunean. ARNaren araztasun maila zehazteko, A260/260 eta A260/230 absorbantzia-erlazioa jakin behar da; honako hau izan behar du: 1,8.
• Osotasuna: 260 nm-eko absorbantziak eta A260/280 erlazioak ematen diguten informazioa ARNaren kantitateari eta ezpurutasun organikoen eta ez-organikoen kutsadura mailari buruzkoa da. ARNaren degradazio mailaz, ordea, ez digute deus esaten. Bi metodo daude ARNaren degradazio maila zehazteko:

       -28S eta 18S erribosoma-banden arteko erlazioa. Agarosako gel batean behatzen dira banda diskretu gisa eta ARN oso batean duten 28S/18S erlazioa 2 ingurukoa da. Gomendatutako erlazioa honako hau da: 28S/18S = 1,2.
       -RIN: ARN Integrity Number; Agilent Technologies-en 2100 Bioanalizatzaileak duen softwarearen algoritmoari aplikatzen zaion zenbakia da. ARNko laginaren degradazio maila adierazten digu. Ongi dagoen ARN lagin batek 9-10 RINa du, eta degradatu batek, berriz, RIN 1.

• DNA genomikoaren kutsadura: gene-adierazpena analizatzeko PCR denbora errealean eta microarrays teknikak erabiliz gero, ARN lagina DNA genomikoaz kutsatzeko arriskua handia da. DNAko kutsadurak, gainera, nabarmen eragin dezake gene-adierazpeneko emaitzaren sentikortasunean eta zehaztasunean. Kutsadura hori saihesteko modurik onena da erauzketa-metodo bat erabiltzea, erauzketa organikoa fenolen (Trizol edo TRI Reagent) eta zutabe bidezko arazketa konbinatuz. Zutabe bidez arazteko kitak daude; horrelakoetan, zutabe bidez DNasarekin tratatzen da lehendabizi, eta ondoren, ARNaren eluzioa egiten da. Gerta daiteke laginak gehiegizko kutsadura maila izatea microarrays edo SYBR Green-ekin (oso garrantzitsua) PCR denbora errealean teknikak aplikatu ahal izateko. Horrelakoetan, lagina DNasarekin tratatu, eta zutabe bidez araztu behar da berriro, tratamendua amaitzean. DNasa erabat ezabatzeak garrantzi handia du, cDNA edo cARN sintesirako beharrezkoa den atzera-transkripzioko erreakzioa eteten baitu.

       -DNA-free: a new method to remove DNA, AMBION
       -Avoiding DNA contamination in RT-PCR
       -RNase free DNase set, QIAGEN
       -RQ1 RNase-free DNase, Promega

Funtsezkoa da analisiaren lagin guztiek araztasun (A260/280) eta osotasun (28S/18s eta/edo RIN zenbakia) maila konparagarriak izatea.
ARNaren kalitateari eta hura analizatzeari buruzko informazio gehiago nahi izanez gero, irakurri AMGBIONen honako ohar hauek:

• Assessing RNA quality: The Good, The Bad and the Ugly
• Is your RNA intact? Methods to check RNA integrity: AMBION TechNote 8(3)
• Assessing RNA quality: AMBION TechNote 11(1)
• Determinants of RNA integrity and Purity: AMBION TechNote 11(2)

ARN erabiltzeko oinarrizko gomendioak

ARNa oso material sentikorra da eta kontu handiz erabili behar da, erribonukleasarekin ez kutsatzeko (RNasa) eta bere degradazioa saihesteko. RNasak oso entzima egonkorrak eta aktiboak dira; ARNa hidrolizatzen dute eta ez dituzte baterako faktoreak behar beren eginkizuna betetzeko. RNasen aktibitatea nekez eteten da, autoiltzatea jasaten dute eta proteinen aktibitatea eteteko metodo estandarrek ez diete eragiten. Garrantzitsua da RNasarik gabeko giroan lana egitea eta materiala tratatu behar da horiek ezabatzeko. Honako gomendio hauen bidez, RNasen kutsadura saihestuko dugu:

• Eskularruak erabiltzea laginak, material suntsigarria eta beirak erabiltzean eta baita ARN ateratzean ere. RNasa asko dago larruazalean, eta hori da, hain zuzen ere, kutsadura-bide nagusia. Laginak ateratzean, lana ahalik eta bizkorren egin behar da RNasen arriskua murrizteko eta ARNaren degradazioa saihesteko.
• Hautazkoa: azalerak, pipetaren ertzak eta tentegailuak RNaseZap (AMBION) edo kutsaduraren aurkako beste soluzio batekin tratatzea. Berariaz ARN erabiltzeko pipetak erabiltzea.
• ARNko lagina izotzetan edo bloke hotzean gordetzea, disolbatzaile organiko batean disolbatuta dagoenean izan ezik.
• Botatzeko material plastikoa (hodiak, pipeten puntak) esterila erabiltzea eta RNasarik ez duela egiaztatzea.
• Beirazko materiala labe batean sartu behar da, eta gau osoan eduki 240 °C-ra. Plastikozko tapoiak eta botatzeko ez den plastikozko materiala, hala nola elektroforesiko kubetak, probetak edo prezipizatu-ontziak 5 minutuz garbitu behar dira 0.1M NaOH, 1mM EDTArekin, eta, ondoren, RNasarik gabeko MilliQ uretan pasatu behar da. Txandaka, kloroformoari eusten dion material plastikoa kloroformoan pasatu daiteke.
• Ura eta soluzioak (Tris-basea dutenak izan ezik) DEPC*-rekin tratatu behar dira (dietil pirokarbonatoa) % 0,1 (v/v ur destilatuan). DEPC %0,1 soluzioa prestatzean, nahastu indarrez soluzioa minutu batez, inkutabu gau osoan erauzketa-kanpaian giro-tenperaturan eta autoiltzatu soluzioa erabili aurretik DEPCaren aktibitatea eteteko. Soluzioak Tris-basea baldin badu, prestatu soluzioa DEPC-ur autoiltzatuarekin.
• Erne: DEPCa toxikoa eta balizko kartzinogenoa da. Erabili eskularruak eta egin prozesu osoa erauzketa-kanpaian autoiltzatze bidez aktibitatea eten arte.
• ARNa DEPCrekin tratatutako edo RNasarik gabeko ur aratzean berriro jartzea gomendatzen da.

ARN ehunetatik isolatzeko gomendioak

ARNa lortzeko lagin freskoak erabiltzea gomendatzen da. ARN ehunetatik isolatzeko 3 aukera edo metodo daude:

• Ehuna lisi soluzioan berehala homogenizatzea (oso azkar gorputzatik eskuratu bezain laster).
• Berehalako homogenizazioa ezinezkoa denan, ehuna gorputzatik eskuratu bezain laster egonkortu behar da. Egonkortzeko bi metodo daude:

       -Ehuna nitrogeno likidoan izoztu behar da, eskuratu bezain laster. Horrela izoztutako ehuna -80 °C-ra gorde daiteke, ARNko lagina atera arte. Ateratzeko, berriz, ehun izoztua zatitu eta pisatu, eta gorde izotz lehorrean lisi soluzioan homogeneizatu arte. Isolamendua errazteko ehun zati txikietan izoztea gomendatzen da (<100 mg).
       -Ehuna gordetzeko beste aukera bat da ARNko soluzio egonkortzailea erabiltzea, hala nola AMBIONen RNAlater-a. Ekoizleak emandako argibideei jarraitu. Metodo hau oso erabilgarria da laginekin giro tenperaturan lan egiteko, edo laginak posta zerbitzuz bialtzeko. Ehun laginen lodiera < 0.5 cm izan behar da, RNAlater soluzioa ondo sartzeko ehun barnekaldera. Hobe da hainbat zati txiki eskuratzea, zati handi bat baino.

Gene-adierazpenaren analisirako kontrol edo erreferentziako laginak eta lagin esperimentalak paraleloan eta prozedura berari jarraituz prozesatzea ezinbestekoa da.
Microarrays eta PCR denbora errealean teknikak oso sentikorrak dira eta kalitate zein osotasun handiko laginak behar dira; ezpurutasunik eta DNA genomikorik gabekoak.

Gene Adierazpenen Unitatean sartzeko, SGIkerretara sartzeko eta eskuragarri dauden zerbitzuak erabiltzeko protokoloan zehaztutako baldintzak bete beharko dira.