Tesis defendidas

Esta Tesis Doctoral evaluó el efecto que tiene sobre el flujo sanguíneo de una arteria vertebral de un diámetro igual o menor a 3 mm el parámetro de inclinación que habitualmente se utiliza en las maniobras manipulativas cervicales. Mediante ecografía Doppler se obtuvieron datos que aportan objetividad y base científica para el buen uso de dichas técnicas en los pacientes mediante la observación de los efectos de la manipulación vertebral en la arteria vertebral. A pesar del uso extendido de la manipulación vertebral, se desconocen los mecanismos fisiológicos que son la base de sus efectos. Esta falta de evidencia científica, aunque no niega los efectos clínicos, impide su aceptación por parte de las comunidades científicas y dificulta que se establezcan estrategias racionales para mejorar su utilización. Los resultados obtenidos indican que no existen diferencias estadísticamente significativas en cuanto a cambios en las variables IR, EP y DF en la arteria vertebral contralateral durante la aplicación de la técnica manipulativa con thrust que incluye el parámetro de inclinación en la columna cervical en participantes con edad comprendida entre 20 y 30 años sin diagnostico articular cervical y sin patología vascular conocida. Basándonos en los resultados obtenidos pretendemos como siguiente paso investigar la influencia del parámetro de inclinación en las variables IR, DF y EP en participantes de edades más avanzadas, ya que la edad es uno de los factores clave en las lesiones arteriales debido a que la modificación de la composición arterial y los signos arteroescleróticos provocan un aumento de la rigidez de la arteria vertebral.

La Demencia Frontotemporal (DFT) engloba a un grupo de enfermedadesneurodegenerativas clínica y neuropatológicamente heterogéneas, que afectan a los lóbulosfrontales y temporales, y cuyos síntomas principales son alteraciones en la conducta, y en ellenguaje con una relativa preservación de la memoria.La historia familiar positiva se presenta en el 25-50% de los casos. En el año 2006 seidentificó la Granulina (GRN) como segundo gen relacionado con DFT, situado en el cromosoma17, con mutaciones en GRN responsables de un importante número de casos con DFT familiar.En el año 2008 se describieron las manifestaciones clínicas de una serie de familias del PaísVasco con la mutación c.709-1G>A en GRN (de Munain et al., 2008).El trabajo que se presenta en esta tesis está dividido en tres estudios cuyo objetivoprincipal es la caracterización cognitiva de portadores asintomáticos de la mutación c.709-1G>Aen GRN y la identificación de rasgos cognitivos alterados en una posible fase preclínica.El primer estudio fue un estudio transversal con una muestra de 13 portadoresasintomáticos y de 19 no portadores. Los resultados mostraron diferencias entre los grupos enel dominio de atención y en una prueba de lenguaje. Por otro lado, en el grupo de portadores, laedad correlacionaba con un peor rendimiento en un mayor número de pruebasneuropsicológicas y además esta relación era de mayor intensidad que en el grupo de noportadores.El segundo estudio fue un estudio de neuroimagen cuyos objetivos eran analizarcambios en el grosor cortical dependiendo de la condición de portadores de la mutación c.709-1G>A y de no portadores y correlacionar estos cambios con las medidas cognitivas. Losresultados revelaron una disminución del grosor cortical en el lóbulo temporal en relación conla edad en los portadores de la mutación.El tercer estudio consistió en un estudio longitudinal en tres visitas espaciadas en dosaños cada una de ellas. Para este estudio se contó con una muestra inicial de 15 portadoresasintomáticos y 25 no portadores. Los resultados en la comparación entre visitas confirmaron laexistencia de diferencias en atención y flexibilidad cognitiva. El seguimiento temporal mostróun declinar marcado en el reconocimiento de emociones en el grupo de portadores. En elseguimiento individual se identificaron a 4 portadores en rangos de Deterioro CognitivoAsintomático.Estudio longitudinal y caracterización cognitiva de portadores de la mutación c .7 0 9 -1 G >A en el gen de laProgranulina.Los resultados de esta tesis confirman la existencia de diferencias cognitivas entreportadores y no portadores y confirman la existencia de una fase preclínica cognitiva conafectación principal del reconocimiento de emociones.

Este trabajo se centra en el estudio de la distrofia muscular de cinturas tipo 2A (LGMD2A) causada por mutaciones en el gen de la calpaina 3. El trabajo ha sido enfocado en el estudio a nivel celular y molecular de esta enfermedad para un mejor conocimiento del mecanismo fisiopatológico subyacente de la misma.Para ello se han realizado estudios in vitro con células musculares provenientes de músculos de pacientes y controles sanos donde se han realizado diversos experimentos con el objetivo de restaurar la homeostasis de la fibra muscular de los pacientes.Por otro lado, los resultados obtenidos de los estudios in vitro, pusieron el foco en la importancia del gen FRZB en la enfermedad. Por ello se estudió el modelo murino deficiente para este gen (Frzb-/-) con el objetivo de averiguar la importancia del mismo en el músculo esquelético.

La esclerosis múltiple es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta al sistema nervioso central y se caracteriza por el daño a los oligodendrocitos y la mielina, la infiltración de células inmunes y la degeneración neuronal. Se sabe que los compuestos cannabinoides, por su acción a través de los receptores CB1 y CB2, son capaces de revertir varios aspectos sintomatológicos de la enfermedad. Aunque la mayoría de estos efectos beneficiosos ocurran por la activación de los receptores CB1 neuronales y los receptores CB2 presentes en las células inmunes, se cree que algunos de ellos podrían estar mediados, al menos en parte, por la activación de receptores CB1 presentes en los oligodendrocitos. De todas formas, hasta el momento no existen datos que confirmen la expresión in situ de este receptor en este tipo celular. En el presente trabajo, utilizando técnicas de microscopía electrónica, hemos descrito por primera vez la localización ultraestructural de los receptores CB1 en las células oligodendrogliales del cerebro de ratón adulto. Por otro lado, se sabe que la utilidad terapéutica de los cannabinoides exógenos es limitada debido a que producen efectos adversos como la psicoactividad. En este sentido, se propone que el aumento de los niveles de los endocannabinoides, en especial el 2-AG, mediante la inhibición de su degradación, podría ser una alternativa terapéutica capaz de producir efectos beneficiosos limitandolos no deseados. En el presente estudio hemos demostrados que la inhibición de la encima ABHD6, capaz de degradar el 2-AG, produce efectos terapéuticos limitados en modelos animales de la esclerosis múltiple.

En el hipocampo, la activación de los circuitos excitatorios resonantes característicos de esta región y su capacidad de retroalimentación se han relacionado con la formación de la memoria; sin embargo, esta retroalimentación positiva podría desencadenar también una excitación mantenida y desorganizada de grupos de neuronas provocando la lesión y muerte celular por la acumulación de calcio hasta niveles tóxicos. Para mantener el adecuado equilibrio entre la necesidad de la excitación para la fijación de los recuerdos y la vitalidad de las neuronas, existen en el hipocampo, una serie de mecanismos de control. Nuestra hipótesis plantea que algunos de estos sistemas reguladores pueden tener su réplica en el hilus para, con la información aportada por las fibras musgosas, actuar como sistema de retroalimentación negativa en la transmisión excitatoria de las células granulares. Para demostrar dicha hipótesis, llevamos a cabo técnicas inmunohistoquímicas para microscopía óptica y electrónica, en las que se emplearon anticuerpos específicos contra los receptores mGlu2/3 y CB1 en ratones mGlu2 knockout (mGlu2KO), mGlu3 knockout (mGlu3KO) y wild tipe (WT), y se examinó la relación topográfica de los receptores metabotrópicos del glutamato del grupo II (mGlu2/3) y el receptor cannabinoide CB1 en el hilus del giro dentado del hipocampo. Se observó marcado para el receptor CB1 tanto en los perfiles neuronales como en los gliales, en los animales de las distintas cepas. Este marcado, pudimos encontrarlo especialmente concentrado en los terminales axonales de las neuronas GABAérgicas, pero también lo localizamos en los terminales sinápticos excitatorios de las fibras musgosas, en los que, además, pudimos observar un tipo de marcado característico asociado a las vesículas sinápticas, o entre ellas. También pudimos demostrar la presencia del receptor CB1 en las células musgosas, cuyos axones hacen sinapsis con las dendritas de las células granulares en la capa molecular del giro dentado. Por otra parte, pudimos comprobar que receptores mGlu2/3 se asociaron, aunque no exclusivamente, a elementos sinápticos y perisinápticos, existiendo diferencias topográficas entre ambos. Así, los receptores mGlu2, aparecieron en el hilus situados postsinápticamente pero también a nivel presináptico. Sin embargo, el receptor mGlu3, lo localizamos exclusivamente en células gliales, concretamente en astrocitos. En algunos casos, pudimos ver finos procesos astrocíticos perisinápticos positivos para el receptor mGlu3, en contacto con presuntas sinapsis glutamatérgicas. En ambos casos el marcado se mostró asociado a sinapsis asimétricas, aunque también pudo verse lejos de las sinapsis. Tras estudiar los dos tipos de marcado en conjunto, se encontraron tanto perfiles neuronales positivos para mGlu2 como procesos astrocíticos positivos para mGlu3 en contacto con botones sinápticos positivos para CB1. Asimismo, se demostró, doble marcado mGlu2-CB1 a nivel pre- y postsináptico y colocalización de mGlu3 y CB1 en algunos perfiles astrocíticos en torno a sinapsis excitatorias axo-espinosas. También se observaron, con frecuencia, procesos gliales doblemente marcados para mGlu3-CB1 en contacto con botones positivos en CB1. Estos resultados indican que la colocalización y asociación de los receptores mGlu2 y mGlu3 y CB1 en los perfiles neuronales y astrogliales del hilus, y la interacción entre ellos, puede ser determinante en la forma en la que las retroproyecciones, de las células hilares, actúan sobre las células granulares influyendo en la actividad del hipocampo.

El envejecimiento es un proceso universal y multifactorial que afecta todas las células, tejidos y organismos. Se caracteriza por el deterioro de la homeostasis tisular, en cuyo proceso, el agotamiento de las células madre juega un papel primordial. El factor de transcripción SOX2 regula el mantenimiento de las células madre adultas pero se desconoce su implicación en el envejecimiento. La presente tesis doctoral tiene como objetivo principal determinar su expresión y función. Nuestros resultados revelan que los niveles de SOX2 se reducen con la edad en diferentes tejidos tanto humanos como murinos, y que su menor expresión se asocia con un declive cognitivo, auditivo y visual. Además, regula el envejecimiento de las células madre adultas comprometiendo la esperanza de vida libre de enfermedad, pero sin afectar la longevidad. Por otro lado, el microambiente está muy implicado en el mantenimiento de las células madre. En el caso de las células madre neurales, se sabe que regula su capacidad de auto-renovación y la neurogénesis. La vía de señalización de P38MAPK se activa con la edad y se ha detectado un aumento en su expresión en diferentes poblaciones de célula madre. En esta tesis, caracterizamos su involucración en el agotamiento de las células madre neurales que ocurre con el envejecimiento. Observamos una activación de esta quinasa en los diferentes nichos neurogénicos con la edad y determinamos que su silenciamiento in vitro mejora la actividad celular y que in vivo compensa el declive cognitivo y el agotamiento de las células madre neurales que ocurre con la edad.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más prevalente de demencia, y se caracteriza por ser una enfermedad neurodegenerativa con daños sinápticos que se correlacionan con una pérdida cognitiva. Los oligómeros de beta amiloide (Aß) contribuyen al desarrollo de la enfermedad, ya que interfieren con receptores sinápticos produciendo cambios en la funcionalidad neuronal y neurotoxicidad. En esta tesis nos proponemos describir la señalización que desencadena el péptido Aß y que modula la funcionalidad de los receptores postsinápticos glutamatérgicos del tipo NMDA en modelos celulares, animales y muestras humanas de la EA. Hemos observado que los oligómeros de Aß provocan una desregulación de la expresión del receptor NMDA en la fracción sinaptosomal de neuronas. Estos cambios están acompañados de alteraciones en el flujo de entrada de calcio inducido por NMDA y son más prominentes en receptores sinápticos que extrasinápticos . Mediante ensayos farmacológicos, hemos descrito que la integrina ß1 y la proteín kinasa C (PKC) están implicada en el mecanismo modulador del NMDA inducido por Aß. Además, muestras postmortem de corteza cerebral humana de controles sanos y pacientes con Alzheimer muestran alteraciones en la subunidad NR2B del receptor NMDA, así como de marcadores pre- y post-sinápticos (Sinaptofisina y PSD-95 respectivamente) en diferentes estadios de la enfermedad.

La microglía examina el microambiente del sistema nervioso central para detectar señales de lesión o infección, y es esencial para el inicio y resolución de la inflamación inducida por patógenos o daño en los tejidos. Comprender los mecanismos de las respuestas de la microglía durante la patología es, por lo tanto, vital para promover respuestas regenerativas. En este trabajo hemos analizado el papel del receptor purinérgico P2X4 en la microglía durante la inflamación autoinmune. El bloqueo de P2X4R exacerbó los signos clínicos en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y favoreció la activación de la microglía a un fenotipo pro-inflamatorio. Además, el bloqueo de P2X4R en la microglía inhibió la diferenciación de oligodendrocitos in vitro. En cambio, la potenciación de P2X4R favoreció el cambio de la microglía a un fenotipo anti-inflamatorio y mejoró los signos clínicos de la EAE. Finalmente, eliminar IRF5, un factor de transcripción importante en la inmunidad innata y que controla la expresión de P2X4R, retrasó el inicio de la EAE. Sin embargo, los signos clínicos se exacerbaron en la fase crónica de la EAE y se observó mayor acumulación de debrís de mielina dentro de las células microgliales, indicando problemas en la fagocitosis. En el modelo de desmielinización inducida por lisolecitina la deleción de IRF5 inhibió el reclutamiento de las células progenitoras de oligodendrocito ala zona de lesión y además generó una respuesta inmune exacerbada. Nuestros resultados proporcionan evidencias de que el eje IRF5-P2X4R modula la respuesta inflamatoria de la microglía e identifican a la IVM como un candidato potencial para promover la reparación del daño de la mielina.

Mugako Nortasunaren Nahasmendua (MNN) atxikimenduaren zailtasunekin lotu izan da, helduaroan bereziki atxikimendu-antsietate maila altuarekin. Bestalde, MNN-n Aurpegi-Emozioen Antzematea (AEA) aztertu dituzten ikerketetan emaitza kontrajarriak argitaratu izan dira. Azkeneko ikerketen azterketek, MNN duten pazienteek aurpegi neutroetan emozioak ezartzeko joera izan dezaketela iradokitzen dute, emozio negatiboekiko isuria aurkeztuz. Horrez gain, atxikimendua eta aurpegi-emozioen antzematearen arteko asoziazioa aztertzen dituzten ikerketen gabezia dago. Tesi honen helburua, MNN duten pazienteen talde kliniko batean giroko aldagaiak (parentalitatea eta helduaroko atxikimendua) eta kognizio sozialeko prozesu jakin bat (AEA) aztertzea da, kontrol talde batekin konparatuz. Horrez gain, aipatutako giroko aldagaiek kognizio sozialeko aldagaiarekiko duten harremana aztertzea ere proposatzen da. Ikerketa proiektuan MNN duten pazienteen talde bat (n=120) kontrol talde (n=220) batekin konparatu egin zen giroko aldagaiak, kognizio sozialeko aldagai bat eta aldagai kliniko ezberdinak aztertuz. Aldagai nagusiak parentalitatea (PBI), helduaroko atxikimendua (ECR-R) eta aurpegi-emozioen antzematea (DFAR) izan ziren. Aldagai soziodemografikoak eta MNNren larritasunarekin erlazionaturiko aldagai klinikoak bildu izan ziren analisi ezberdinak egiteko. Taldeen ezberdintasunez gain, aldagaien arteko harremana ere aztertu izan zen. Emaitzetan, MNN zuten pazienteek haien gurasoak parentalitate disfuntzional estiloekin identifikatzen zituztela aurkitu zen. MNN zuten pazienteek atxikimendu-antsietate eta atxikimendu-saiheste maila altuagoak aurkeztu zituzten. AEAren guztizko eskala kontuan hartuta, MNN zuten pazienteek ez zituzten desberdintasunik aurkeztu kontrol taldearekin alderatuta. Emozio zehatzei erreparatuta, talde klinikoko partaideek aurpegi neutroen antzematean zailtasunak aurkeztu zituzten eta beldur aurpegiak antzematean, berriz, hobekuntza kontrol taldearekin alderatuta. Parentalitate neurriek helduaroko atxikimenduko neurriekin asoziazioa aurkeztu zituzten. Ez ziren helduaroko atxikimenduko eta AEAren arteko asoziazio esanguratsurik aurkitu. Lehenengo mailako zaintzaileekiko harremanaren eta helduaroan ematen diren psikopatologiako adierazpenen arteko lotura indartzen dute tesiaren emaitzek. Bestalde, MNN duten pazienteek aurpegi neutroetan emozio negatiboak ezartzeko eta emozio negatiboak hobeto antzemateko joera daukatela aurkitu zen, azken ikerketekin bat etorriz. Azkenik, helduaroko atxikimenduak AEAn eraginik ez duela aurkitu zen, aurretiko ikerketekin kontrastatuz, beraz emaitza ezberdin hauek etorkizunean argitzea proposatzen da ikerketa berriekin.

Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET) son un grupo de enfermedadesneurodegenerativas fatales que se caracterizan por el acúmulo de fibras amiloides de la proteína PrPSc enel sistema nervioso central de los pacientes. Debido a que no existe ningún tratamiento disponible paraestas enfermedades, uno de los principales objetivos del campo de estudio de las EET es la búsqueda defármacos que inhiban o retrasen el proceso de propagación de las fibras amiloides. Para ello, el uso desistemas de cribado masivo de compuestos con posible actividad anti-priónica es uno de los métodos másprometedores. En esta tesis doctoral se ha desarrollado con éxito un sistema de propagación in vitro depriones altamente infecciosos y aplicable a un método de cribado masivo. Utilizando este novedosométodo, se ha cribado una biblioteca de 2500 compuestos, detectándose 3 compuestos con actividadinhibidora no descritos hasta la actualidad. A continuación, se ha confirmado su actividad inhibidora de lapropagación utilizando otros métodos de propagación in vitro e in cellula, demostrando la utilidad elnuevo sistema de propagación in vitro para el descubrimiento de nuevos compuestos con actividad antipriónica y abriendo una puerta a un posible tratamiento de estas enfermedades fatales mediante loscompuestos descritos en esta tesis doctoral.

DEMENCIA FRONTOTEMPORAL POR MUTACIONES EN EL GEN DE LA PROGRANULINA. ASPECTOS CLÍNICOS Y MOLECULARES.La demencia frontotemporal (DFT) comprende un grupo de enfermedades neurodegenerativas, clínica y neuropatológicamente heterogéneo, que se agrupan por la afectación predominante de los lóbulos frontal y temporal del cerebro, con síntomas de alteración progresiva de la conducta, la personalidad y el lenguaje, y con relativa preservación de la memoria. La DFT tiene un importante componente genético y se encuentra una historia familiar positiva entre un 25-50% de los casos. En el año 2006 se describieron mutaciones en el gen de la progranulina (GRN), en el cromosoma 17q21-22, en pacientes con DFT familiar con neuropatología consistente en inclusiones tau-negativas y ubiquitin-positivas. Más adelante se describió que el componente principal de estas inclusiones patológicas era la proteína TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43). En el año 2008 se identificó la mutación c.709-1G>A en GRN en una serie de familias de origen vasco.El trabajo presentado en esta tesis se divide en cinco estudios, cuyo objetivo principal es la caracterización clínica de los pacientes con DFT portadores de la mutación c.709-1G>A en GRN y el estudio de los portadores asintomáticos de la mutación, para detectar la posible existencia de cambios neuropsicológicos o de neuroimagen previos al inicio de síntomas clínicos. El primer estudio analiza el fenotipo clínico de 21 pacientes con la mutación c.709-1G>A en GRN. Los pacientes mostraron un fenotipo variable, tanto en la edad de inicio como en los síntomas de presentación. La demencia frontotemporal variante conductual (DFTvc) y la afasia progresiva no fluente (APNF) fueron los síndromes de presentación más frecuentes. Un porcentaje alto de pacientes desarrollaron un síndrome corticobasal como diagnóstico secundario. El objetivo del segundo estudio era determinar si determinadas variantes genéticas modificaban la edad de inicio de la enfermedad en nuestra serie de 21 pacientes con la mutación c.709-1G>A en GRN. Se incluyeron las siguientes variables genéticas: polimorfismos rs5848 y rs9897526 en GRN, APOE, el haplotipo del gen de la proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT) y el polimorfismo del codón 129 en el gen de la proteína priónica (PRNP). Encontramos una asociación entre el polimorfismo del codón 129 de PRNP y la edad de inicio de la enfermedad, de forma que los portadores homocigotos MM presentaban una edad de inicio media 8.5 años menor que los pacientes portadores de al menos una valina en su codón 129 de PRNP (MV o VV). El tercer estudio es un estudio transversal que compara la evaluación neuropsicológica de una muestra de 13 portadores presintomáticos de la mutación c.709-1G>A en GRN con la de 19 familiares no portadores. Los portadores presintomáticos de la mutación c.709-1G>A en GRN presentaron unas puntuaciones significativamente peores que los sujetos no portadores en pruebas de atención, flexibilidad mental y lenguaje, sugiriendo la existencia de una fase prodrómica que precede al inicio de los síntomas de DFT. El cuarto estudio analiza la neuroimagen estructural mediante comparación del grosor cortical en 13 portadores de la mutación c.709-1G>A en GRN frente a un grupo de 13 sujetos sanos pareados por edad y sexo. Los portadores asintomáticos mostraron un menor grosor cortical asociado a la edad en diferentes zonas del lóbulo temporal. Además, el grosor cortical se correlacionaba con puntuaciones en diferentes pruebas neuropsicológicas (Trail Making Test A y B y Test de Denominación de Boston). El menor grosor cortical en portadores presintomáticos en el córtex temporal lateral sugiere un efecto precoz y específico de la enfermedad en estas áreas.Por último, el quinto estudio tenía como objetivo evaluar la influencia de la variante p.A152T en MAPT en el fenotipo clínico y neuropatológico de las familias vascas portadoras de la mutación c.709-1G>A en GRN. El grupo de pacientes con ambas alteraciones genéticas (GRN+/p.A152T+) presentaba unas características clínicas similar al grupo que solamente presentaba la mutación en GRN (GRN+/p.A152T-). Se analizaron siete autopsias cerebrales (6 GRN+/p.A152T+ y 1 GRN+/p.A152T-), y todas presentaban, además de los hallazgos característicos de las mutaciones en GRN (DLFT-TDP tipo A), inclusiones tau patológicas en grado leve a moderado, no acompañadas de patología ¿-amiloide, excepto en dos casos en que coexistía enfermedad de Alzheimer. Se especula que la variante p.A152T en MAPT en portadores de la mutación c.709-1G>A en GRN podría conferir una mayor predisposición a presentar patología tau cerebral asociada.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la pérdida de memoria y disfunciones cognitivas, entre las cuales se incluyen problemas del lenguaje, desorientación, pérdida de la capacidad de organización y planificación y otros síntomas neuropsiquiátricos, hasta la llegada a un estadio final, en el cual el paciente precisa de una asistencia total. Las principales característica patológicas son la atrofia cortical, la pérdida de neuronas y sinápsis, la acumulación de la proteína B-amiloide, la deposición de placas seniles y la formación de ovillos neurofibrilares (MNFs) constituidos por la proteína tau hiperfosforilada.

Duchenne muskulu-distrofia (DMD) gaixotasun neuromuskular larria da eta X kromosoman dagoen distrofinaren geneko mutazio azpirakorrak dira erantzuleak. 3500 mutiletik bati eragiten dio batez beste eta, gaur egun, sendabiderik ez duen eta heriotza goiztiarra dakarren gaitza da. DMDn gihar-eskeletikoa eta bihotza kaltetuta daude, ahultasun eta endekapen progresiboa eta, azken fasean, bihotzeko gutxiegitasuna eraginez; horrez gain, gaixoen %30ak nerbio-sistema zentralean ere arazoak ditu. Distrofina ez izateak zeluletako estres nitro-oxidatzailea areagotzen du eta hainbat proteinetan itzulpen-ondorengo aldaketak eragiten ditu. Besteak beste, kaltzio-kanal diren rianodina-hartzaileen (RyR) konformazioari eragiten die ezin baitzaie kalstabina behar bezala lotu eta kalstabina batuta ez dagoenean RyR ez da behar bezala itxiko kaltzio-jarioak eraginez.Lan honen helburua kalstabina proteina modulatuz RyR kaltzio-kanalen funtzioa berrezartzeko diseinatu diren AHK molekulen eraginkortasuna aztertzea izan da Duchenne muskulu-distrofiaren animalia-eredu diren sapje zebra-arrainetan eta mdx saguetan. Zebra-arrainetan AHK molekulek itu berarekin diseinatutako beste konposatu batzuk baino toxikotasun gutxiago dute, eta sapje arrainetako fenotipo distrofikoa aldatzen ez duten arren, AHK1ek eta AHK2k indar aktiboa emendatzen dute. AHK2a giharrera, bihotzera eta garunera heltzen dela baieztatu da mdx saguetan. Animalia-eredu honetan AHK2aren 12 asteko tratamenduaren ondoren hobekuntza nabarmenak ikusi dira bihotzaren funtzionamenduan eta saguei egindako kognizio probetan. Funtzio muskularrari dagokionez, aurrez 5 asteko tratamenduarekin maila funtzional eta histopatologikoan ikusitako hobekuntzak diluituago ageri dira 12 asteko tratamenduaren ondoren; honela, AHK2ak mdx saguen giharretan duen eraginkortasuna gaixotasunaren eboluzioarekin gutxitzen dela ebatzi da.

Las anomalías congénitas del Sistema Nervioso Central (ACSNC) se dan en el 1% de los nacimientos y suponen una causa importante de muerte neonatal y discapacidad a largo plazo. El diagnóstico suele realizarse a nivel prenatal, el pronóstico puede ser variable y la decisión supone continuar o terminar el embarazo. El objetivo de este estudio es describir las características clínicas, epidemiológicas y pronóstico de las ACSNC en el País Vasco y principalmente en Gipuzkoa, a través de los datos recogidos en el registro de anomalías congénitas del País Vasco (RACAV) durante los años 1990 a 2011. Se ha observado un aumento de la prevalencia de las ACSNC a lo largo de este periodo, principalmente por el aumento de los casos detectados prenatalmente. Los defectos del tubo neural (DNT) son los más prevalentes, seguidos de la hidrocefalia. La prevalencia de DTN no ha disminuido a pesar de la instauración oficial de la recomendación de la toma de ácido fólico periconcepcional en el 2001. Se conoce la etiología en el 22% de los casos, 14% son debidas a anomalías cromosómicas, 5% se engloban dentro de un síndrome concreto y 3% son secundarias a factores ambientales. De manera global, el 60% de las malformaciones acaban en interrupción voluntaria del embarazo (IVE), 38% nacen vivos y 2% nacen muertos. El factor más importante para decidir seguir o no con el embarazo es el momento de detección de la anomalía. De los casos nacidos vivos, la supervivencia depende de las anomalías asociadas en otros órganos.

SARRERA: Urdaileko minbizia difusoaren (UMD) prebalentziak gora egin du pixkanaka, heste-motarekin berdindu arte. Arazo kliniko eta terapeutiko handiak sortzen ditu, orain arte erabilitako tratamenduei ez baitie ondo erantzuten. Kirurgiaren hedadura, azpimota molekular proteomiko eta genomikoen arabera doitzeak paziente horien pronostikoa ho- betu dezake. MATERIALA ETA METODOAK: Biziraupen-analisia duten atzera begirako bi azterlan deskribatzaile eta analitiko egin dira Gurutzetako Unibertsitate Ospitalean, 2005- 2014 artean diagnostikatutako 1052 urdaileko minbizi kasuren inguruan. Gainera, UMDaren 3 kasuren pieza kirurgikoen kromatografia likido eta masa-espektrometria bidezko azter- keta proteomikoa eta lortutako datuen analisi sistematizatua egin dira. Bestalde, minbizi gastrikoaren tratamenduan ¿% 95eko gastrektomia¿ berrikuntza teknikoaren segurtasuna baloratu da. EMAITZAK: UMDak proportzio handiagoan eragiten die emakumeei eta gaz- teei. Fase aurreratuetan diagnostikatzen da, eta nabarmentzekoak dira erasan gangliona- rraren tasa altua eta peritoneo-bideko barreiadura izateko joera. Pazienteen herenak bai- no gutxiagok irauten du 5 urte bizirik. Gaixotasunaren barreiatzea eta jasotako tratamendu kirurgiko eta kimioterapiko mota dira biziraupen orokorrarekin zuzenean erlazionatu diren faktoreak. Ikerketa proteomikoan, aurkitutako 12.551 produktu genikoetatik 2.197 proteina kuantifikatu dira; horietatik 75 nabarmendu dira, 45 tumore-ehunean, eta 30 ehun osasunt- suan. Detektatutako proteinen ehuneko handi bat zelulaz kanpoko matrizeari dagokio, eta horrek mikroingurune tumoralaren gaineko proteomaren garrantzia islatzen du. Identifika- tutako proteinen funtzio molekularrak, epitelio mesenkima trantsizioan, ziklo zelularrean eta DNAren erreplikazioan parte hartzea dira. Aztertutako kasu bakoitzaren profil pro- teomikoak aurrez deskribatutako UMDaren proteomaren maparekin konparatuta, kasu bakoitzaren azpimota molekularra identifikatu ahal izan da eta klinikarekin bat datorrela egiaztatu. EZTABAIDA: Urdaileko minbiziaren genoma eta proteomaren deskribapenean egin berri diren aurrerapenek helburu klinikoekin aplikatzen hasi behar direnak sailkapen molekular berriak ekarri dituzte. Gaur egun, posible da metodologia proteomikoa aplikat- zea ebakuntza-gelan lortutako eta tumore-bankuetan gordetako tumore-laginen gainean, UMDaren sailkapen molekularra lortu eta bai diagnostiko zein tratamenduari buruzko era- bakiak hartzen laguntzeko. Kirurgia-marjinak hobeto definituz erauzketa lokala gidatzea; linfadenektomia egokiena orientatzea; peritoneo-barreiatzea iragarri eta tratamendu- rik onena aukeratzea; eta diana terapeutiko espezifiko onenak baloratzea dira, besteak beste, metodologia hori UMDaren tratamendu onkologikorako aplikatzearen abantailak. ONDORIOAK: Datu kliniko patologikoekin integratutako sailkapen molekular proteomi- koa lagungarria da UMDaren kirurgia eta tratamendu gehigarria gidatzeko, doitasunezko kirurgiaren testuinguruan. --------INTRODUCCIO¿N: La prevalencia del carcinoma ga¿strico difuso (CGD) ha aumentado de manera progresiva hasta igualar la incidencia del tipo intestinal. Este tumor plantea proble- mas cli¿nicos y terape¿uticos ya que no responde bien a los tratamientos empleados hasta el momento. La extensio¿n de la cirugi¿a ajustada a los subtipos moleculares proteomicos y geno¿micos, puede mejorar el prono¿stico de estos pacientes. MATERIAL Y ME¿TODOS: Se han realizado, dos estudios retrospectivos descriptivos y anali¿ticos con ana¿lisis de su- pervivencia, sobre una poblacio¿n de 1052 casos de ca¿ncer ga¿strico diagnosticados en el Hospital Universitario Cruces (HUC), entre 2005-2014; adema¿s, un estudio proteo¿mico por cromatografi¿a li¿quida y espectrometri¿a de masas de las piezas quiru¿rgicas de 3 casos de CGD y un ana¿lisis sistematizado de los datos obtenidos. Por otro lado, se ha valorado la seguridad de una innovacio¿n te¿cnica de la gastrectomi¿a del 95% en el tratamiento del ca¿ncer ga¿strico. RESULTADOS: El CGD afecta en mayor proporcio¿n a mujeres y a per- sonas jo¿venes. Se diagnostica en estadios avanzados y destacan la importante tasa de afectacio¿n ganglionar y la tendencia a presentar diseminacio¿n peritoneal. Menos de un tercio de los pacientes sobrevive a 5 an¿os. La diseminacio¿n de la enfermedad y el tipo de tratamiento quiru¿rgico y adyuvante recibido, son factores que se han relacionado di- rectamente con la supervivencia general. En el estudio proteo¿mico, se han cuantificado 2197 protei¿nas, de los 12551 productos ge¿nicos encontrados; 75 de ellas mostraron di- ferencias significativas. 45 fueron reguladas al alza en el tejido tumoral y 30 reguladas al alza en tejido sano. Un porcentaje amplio de las protei¿nas detectadas pertenecen a la matriz extracelular, lo que refleja la importancia del proteoma del sobre el microambiente tumoral. Son funciones moleculares de las protei¿nas identificadas, participar en la transi- cio¿n epitelio mese¿nquima, en el ciclo celular, y en la replicacio¿n del ADN. La comparacio¿n de los perfiles proteo¿micos de cada caso analizado con el mapa del proteoma de CGD previamente descrito, ha permitido identificar el subtipo molecular de cada uno de los casos, constatando su coincidencia con la cli¿nica. DISCUSIO¿N: Los recientes progresos realizados en la descripcio¿n del genoma y proteoma del ca¿ncer ga¿strico han dado como resultado nuevas clasificaciones moleculares que deben comenzar a aplicarse con obje- tivos cli¿nicos. Actualmente es factible la aplicacio¿n de la metodologi¿a proteo¿mica sobre muestras tumorales obtenidas en quiro¿fano y preservadas en bancos de tumores, con el objetivo de obtener una clasificacio¿n molecular de CGD, que ayude a tomar decisiones de diagno¿stico y terape¿uticas. Guiar la reseccio¿n local mediante una mejor definicio¿n de los ma¿rgenes quiru¿rgicos; orientar la linfadenectomi¿a ma¿s adecuada; predecir y elegir el mejor tratamiento de la diseminacio¿n peritoneal y valorar las mejores dianas terape¿uticas especi¿ficas, son algunos de las consecuencias de la aplicacio¿n de esta metodologi¿a para el tratamiento oncolo¿gico del CGD. CONCLUSIONES: La clasificacio¿n molecular proteo¿- mica integrada con los datos cli¿nico patolo¿gicos, ayuda a guiar la cirugi¿a y el tratamiento adyuvante del CGD, en el contexto de la cirugi¿a de precisio¿n. ------INTRODUCTION: The prevalence of diffuse gastric carcinoma (DGC) has progressively increased to equal the incidence of the intestinal type. This tumor poses clinical and the- rapeutic problems since it does not respond well to the treatments used so far. The ex- tension of the surgery adjusted to the proteomic and genomic molecular subtypes can improve the prognosis of these patients. MATERIAL AND METHODS: Two descriptive and analytical retrospective studies with survival analysis was carried out on a popula- tion of 1052 cases of gastric cancer diagnosed at the Cruces University Hospital between 2005-2014. In addition, a proteomic study by liquid chromatography and mass spectro- metry of the surgical specimens from 3 cases of DGC and a systematized analysis of the data was obtained. On the other hand, the safety of ¿95% gastrectomy¿ technical inno- vation in the treatment of gastric cancer has been assessed. RESULTS: DGC is more com- mon in women and young people. It is diagnosed in advanced stages and the significant rate of lymph node involvement and the tendency to present peritoneal dissemination stand out. Less than a third of patients survive to 5 years. The spread of the disease and the type of surgical and adjuvant treatment received are factors that have been directly related to overall survival. In the proteomic study, 2,197 proteins were quantified, of the 12,551 gene products found; 75 of them showed significant differences. 45 were up-re- gulated in tumor tissue and 30 were up-regulated in healthy tissue. A large percentage of the proteins detected belong to the extracellular matrix, which reflects the importance of the proteome on the tumor microenvironment. The molecular functions of the identi- fied proteins, participate in the mesenchymal epithelial transition (TEM), in the cell cycle, and in DNA replication. Comparison of the proteomic profiles of each case analyzed with the previously described DGC proteome map has made it possible to identify the mole- cular subtype of each of the cases, confirming its coincidence with the clinical picture. DISCUSSION: Recent progress in the description of the GC genome and proteome has resulted in new molecular classifications that must begin to be applied for clinical pur- poses. Currently, it is feasible to apply the proteomic methodology on tumor samples obtained in the operating room and preserved in tumor banks, with the aim of obtaining a molecular classification of DGC, which helps to make diagnostic and therapeutic de- cisions. To guide local resections by better definition of the surgical margins; to orient the most appropriate lymphadenectomy; predicting and choosing the best treatment for peritoneal dissemination and assessing the best specific therapeutic targets are some of the consequences of applying this methodology for the oncological treatment of DGC. CONCLUSIONS: The proteomic molecular classification integrated with the clinical pa- thological data helps to guide the surgery and the adjuvant treatment of CGD, in the con- text of precision surgery.

Ingurune aberastua (IA) erabilera anitzeko eta balio terapeutiko handiko tresna da, baina gaixotasunneuropsikiatrikoetan duen balio potentziala ez da sakon aztertu. Ingurune aberastuak eskizofreniarensintoma kognitiboengan ondorio onuragarririk duen edo ez aztertzeak interes handia du, bai prebentziotresna gisa, bai sendabide gisa. Izan ere, ingurune aberastuak eragindako geneen aktibazio eta proteinensintesiak interneuronen adierazpena eta haien jarduera areagotu dezake. Honek, aldi berean, eraginzuzena izango luke portaeran eta kognizioan. Aldaketa hauek eskizofreniaren galera kognitiboakarintzeko funtsezkoak lirateke. Beraz, lan honen helburua MK-801 bidez sortutako eskizofrenia animaliereduan,bai portaeran zein maila zelularrean eta molekularrean garatutako alterazioak inguruneaberastuaren bidez nola aldatzen diren aztertzea da.

La depresión es el trastorno psiquiátrico más extendido y pese a sertambién uno de los más estudiados, aún se desconocen los mecanismosimplicados en su etiología. Existen, no obstante, cada vez másevidencias de una implicación del sistema inmune en la patogenia de ladepresión.Recientemente se han realizado varios estudios de meta-análisis dóndealgunos marcadores inflamatorios, como la interleuquina 6 (IL-6), sehan asociado con la depresión mayor en humanos, pero no hemosencontrado este tipo de estudios meta-analíticos sobre estasdiferencias en citoquinas en modelos animales de depresión.El objetivo de este trabajo es la valoración de la asociación entre laconcentración de moléculas inflamatorias y la presencia de conductas"depresivo-like" en modelos animales de depresión y su relevancia enla investigación translacional mediante el análisis de la variación dela cantidad de interleuquina 6 en modelos animales de depresióninducidos por estrés provocando un fenotipo "depresivo-like" de maneracrónica y si los resultados encontrados en la experimentación animaljustifican el paso hacia la experimentación en humanos.Mediante una búsqueda bibliográfica en MEDLINE y EMBASE con diferentescombinaciones de palabras clave, encontramos 43 estudios originalesque cumplían los criterios de inclusión, de los que obtuvimos 59 datosque provenían de muestras de cerebro o sangre de modelos animales dedepresión inducidos por estrés con efecto crónico y no modificadosgenéticamente y valoramos la calidad de estos estudios calculando elriesgo de sesgos mediante la "SYRCLE¿s tool for assessing risk ofbias".Utilizando el programa R, calculamos la diferencia estandarizada de lamedia (DEM) y su intervalo de confianza del 95%, mediante el modelo deefectos aleatorios, a partir de la "g de Hedges", estimando el tamañodel efecto de cada uno de los estudios (TE) y su error estándar (eeTE)a partir de las medias de la concentración de IL-6 en los animalessometidos a estrés y los controles y el número de animales en cadagrupo.Exploramos la heterogeneidad entre los estudios y sus posibles causasmediante la construcción de un gráfico de Baujat, análisis deinfluencia, análisis de subgrupos y análisis de meta-regresión.RESUMEN2Valoramos también el posible sesgo de publicación o efecto de pequeñosestudios a través del funnel plot, la prueba de asimetría de Egger yel método de trim and fill.Los resultados del meta-análisis han mostrado un aumento significativo(DEM=1,39; IC-95%=[1,11-1,67]; p<0,0001) de los niveles de IL-6 en losmodelos animales de depresión frente a sus controles. Encontramos unaheterogeneidad muy alta (I2 = 94,8%) entre los estudios no explicada nipor ningún estudio individual (1,34 < DEM < 1,45; 94,3% < I2 < 94,9%),ni por ninguna de las características de los estudios examinadas en elanálisis de subgrupos (I2 subgrupos ¿ 86,7%). El meta-análisisacumulativo mostró una tendencia, que se va acrecentandoprogresivamente desde el año 2013, a un aumento de la concentración deIL-6 en los modelos animales y utilizando el método de trim and fillhemos observado un posible sesgo de publicación hacia éstos valores deaumento de IL-6 en modelos animales.Observamos que la inducción de un fenotipo depresivo-like mediante laaplicación de modelos de estrés crónico aumenta la concentración de lainterleuquina 6 de manera significativa, pero la alta heterogeneidadencontrada entre los estudios, no explicada por ningún estudioindividual, ni por diferencias entre los subgrupos, no permite validarestos resultados.Además, encontramos un posible sesgo de publicación o de pequeñosestudios hacia un aumento del tamaño del efecto de la inducción de losmodelos de depresión sobre la concentración de la interleuquina 6.Los métodos de cuantificación de riesgo de sesgos y validez deestudios animales no son válidos en muchas ocasiones y la calidad delos estudios encontrados es baja o muy baja para la realización de unmeta-análisis.Por lo tanto, los estudios clínicos centrados en la variación de lainterleuquina 6 en individuos deprimidos no estarían justificados porlos resultados obtenidos en estudios en animales ya que, en base anuestros resultados, la relación entre marcadores inflamatorios y ladepresión, aunque significativa, presenta una calidad de la evidenciamuy baja, con una alta heterogeneidad de resultados no explicada y unafuerte sospecha de sesgo de publicación.

Esta tesis doctoral ha consistido en el estudio de la implicación de la señalización GABAérgica en el proceso de diferenciación de las células oligodendrogliales, así como en la mielinización y en la remielinización que se produce tras lesiones desmielinizantes. Se ha demostrado, tanto en modelos in vitro como in vivo, que las células oligodendrogliales expresan los principales componentes del sistema GABAérgico (receptores, transportadores y enzimas) a lo largo de su desarrollo y son capaces de sintetizar y almacenar GABA. Además, se ha observado que la señalización GABAérgica a través de los receptores de GABAB contribuye a la diferenciación oligodendroglial, tanto en condiciones fisiológicas como es el desarrollo, como en contextos patológicos tras inducir una desmielinización experimental. Este trabajo, por tanto, contribuye al conocimiento sobre la biología de los oligodendrocitos y señala a los receptores de GABAB como una posible diana terapéutica para el desarrollo de terapias remielinizantes, imprescindibles para el tratamiento de enfermedades como la esclerosis múltiple.

La microglía es el macrófago residente del sistema nervioso central (SNC). Estos centinelas cerebrales ¿escanean¿ continuamente el parénquima cerebral con sus procesos delgados, largos y ramificados que ayudan a mantener la homeostasis tisular y desempeñar una de sus funciones principales: fagocitosis o ¿comer células¿. Estos centinelas cerebrales pueden fagocitar diferentes tipos de material durante condiciones fisiológicas y patológicas. No obstante, en esta tesis doctoral nos centramos en la fagocitosis de células en proceso de apoptosis o muerte celular programada, un fenómeno generalizado que ocurre durante el desarrollo del cerebro pero también en patología. La eliminación eficaz de las células muertas es crucial para evitar que las células apoptóticas pierdan la integridad de la membrana y filtren contenidos intracelulares potencialmente tóxicos en el tejido circundante.En esta tesis doctoral, exploramos la respuesta fagocítica de la microglía hipocampal tanto postnatal como adulta bajo distintos desafíos apoptóticos inducidos por lipopolisacáridos bacterianos (LPS), administración de etanol (EtOH), encefalopatía hipóxica-isquémica (HIE), irradiación cranial (CIR), oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAo) como modelos de accidente cerebrovascular, e inyección de ácido kaínico intrahipocampal (KA) como modelo de epilepsia del lóbulo temporal medio (MTLE). Además, analizamos otro tema relacionado con la fagocitosis del hipocampo hasta la edad adulta: la supervivencia de las células recién nacidas en la cascada neurogénica del hipocampo adulto. delEn la primera parte de este estudio, analizamos la respuesta fagocítica de la microglía postnatal (postnatal día 9 y 14, P9-P14) en distintos modelos in vivo: LPS, EtOH y HIE. El tratamiento con LPS no provocó un aumento de la apoptosis en ninguna edad posnatal y, por lo tanto, no fue un modelo útil para estudiar la fagocitosis microglial. Por el contrario, EtOH aumentó el número de células muertas, pero la respuesta fagocítica al desafío fue diferente a P9 y P14. En P14, la fagocitosis permaneció estrechamente acoplada a la apoptosis, es decir, el aumento en el número de células apoptóticas se corresponde con un aumento en la fagocitosis microglial. Por lo tanto, en este escenario hubo acoplamiento entre fagocitosis/apoptosis (Ph/A). En P9, sin embargo, el incremento en la capacidad fagocítica no fue suficiente para compensar la cantidad de células muertas, lo que condujo al desacoplamiento de la relación fagocitosis/apoptosis. Se encontró una respuesta fagocítica similar en ratones P9 sometidos a HIE, donde la microglía también aumentó su capacidad fagocítica y el número de células microgliales, pero ambas estrategias no pudieron igualar el incremento de la apoptosis y, como resultado, se perdió el acoplamiento fagocitosis/apoptosis. Estos hallazgos sugirieron una maduración del potencial fagocítico microglial entre P9 y P14.En la segunda parte de esta tesis, cuantificamos la eficacia fagocítica de la microglía adulta (2-3 meses) bajo diferentes retos apoptóticos inducidos por CIR, HIE, tMCAo y KA. Mientras que la microglía mostró una faceta ¿superfagocítica¿ después del tratamiento con CIR, el escenario fue totalmente opuesto tras las condiciones de HIE, tMCAo y KA, donde la fagocitosis microglial estaba bloqueada. Cabe mencionar que este bloqueo no fue compensado por células periféricas ni residentes con potencial fagocítico. Además, observamos que la disfunción fagocítica de la microglía estuvo acompañada de un proceso denominado fagoptosis o fagocitosis de células no apoptóticas, aunque este fenómeno se produjo con menor frecuencia que la fagocitosis de células apoptóticas. Por lo tanto, la microglía no utilizó su reservorio fagocítico para enfrentar el desafío apoptótico inducido por el tratamiento con HIE, tMCAo y KA, y como consecuencia, la eficiencia fagocítica se redujo notablemente.En la tercera y última parte de este estudio, nos enfocamos en otro punto importante relacionado con la fagocitosis microglial en el hipocampo: la supervivencia de células recién nacidas a lo largo de la edad. Nuestro grupo descubrió que las células recién nacidas del hipocampo mueren en dos períodos: 1, un período crítico temprano principal, en el que el 56% de las células se pierden en los primeros 1-4 días después del nacimiento celular, y 2, un período secundario tardío, en el que otro 25% de las células recién nacidas perecen a los 4-8 días de vida celular. Ahora exploramos si estos períodos de supervivencia se mantuvieron durante la edad adulta y, por lo tanto, si la cascada neurogénica adulta podría usarse como modelo para analizar la fagocitosis en ratones en etapas más maduras. Nuestro estudio mostró que la dinámica de la producción y supervivencia de las células del recién nacido fue en gran medida idéntica durante la edad adulta (de 1m a 12m). Además, descubrimos que el número de células recién nacidas que se diferencian en nuevas neuronas era proporcional al número de neuroprogenitores en proliferación de 1m a 12m. Sin embargo, el número de células recién nacidas que se diferencia en nuevos astrocitos aumentó en ratones maduros (6-12 m) y se relacionó con una mayor supervivencia neta a los 30 días, y como resultado, el nicho cambia de neurogénico a neuro/astrogénico en ratones maduros. Finalmente, nuestros datos demostraron que la cascada neurogénica del hipocampo es un modelo útil para estudiar la fagocitosis microglial en ratones envejecidos.

La enfermedad de Parkinson (EP) se caracteriza principalmente por la presencia de inclusiones citoplasmáticas llamadas cuerpos de Lewy, cuyo principal componente es la ¿-sinucleína y la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Los astrocitos constituyen el subtipo glial más abundante en el cerebro, que cubre funciones esenciales para la homeostasis cerebral y la salud neuronal. La disfunción de la biología de los astrocitos en el mesencéfalo puede derivar en el daño de las neuronas dopaminérgicas y una mayor propagación de la EP.En este estudio, hemos utilizado dos modelos diferentes con el objetivo de comprender el papel de los astrocitos en el inicio y la propagación de la EP y descifrar el mecanismo celular que caracteriza el metabolismo de astrocitos en la patología. Por un lado hemos utilizado una quimera in vitro tratando células de rata con extractos de LB humanos. Por otro lado hemos generado y caracterizado astrocitos humanos derivados de iPS de pacientes con EP que portan la mutación LRRK2G2019S.Hemos podido concluir que los astrocitos disfuncionales cubren un papel esencial en el inicio y la progresión de la EP. Tanto la acumulación de ¿-syn como la mutación LRRK2G2019S inducen un desequilibrio mitocondrial que conduce al daño celular y a la degeneración neuronal final. Este estudiopropone un nuevo objetivo terapéutico posible dirigido a mantener la funcionalidad astrocítica. Se necesitan más experimentos para establecer las vías mediante las que los astrocitos podrían inducir la muerte dopaminérgica

El esquema corporal, en relación a la representación corporal plástica y dinámica que deriva de las percepciones sensoriales, está distorsionado en algunas patologías que cursan con dolor crónico. Actualmente el modelo de distorsión de la somatotopía sensorio-motora se relaciona con la fisiopatología del dolor crónico y es susceptible de ser modificable mediante neurorrehabilitación. Aunque existan indicios de que la cronificación del dolor en el síndrome de fibromialgia (SFM) pueda responder a los mismos principios básicos se desconoce el estado del esquema corporal en sujetos con SFM y si es modulable mediante intervención.Primero se han evaluado en una muestra de pacientes con SFM, y contrastado con una muestra control, variables relacionadas con el esquema corporal. Para ello, a nivel experimental se han inducido dos procedimientos de ilusión perceptiva: (i) ilusión de la mano de goma que induce la percepción de que una mano falsa es reconocida como propia e (ii) ilusión del espejo que genera incongruencia sensorio-motora. Los resultados demuestran distorsión del esquema corporal en el SFM caracterizada por inestabilidad de la representación corporal y mayor susceptibilidad a experimentar sensaciones somatosensoriales anómalas. Además, se acompaña de una percepción sesgada sobre la propia imagen corporal junto con mayor una sensibilidad o atención hacia la percepción interoceptiva.Por último, partiendo de la hipótesis de que los trastornos de la agudeza táctil se encuentran directamente relacionados con cambios en la reorganización cortical somatosensorial, y que su intervención puede ayudar a corregir la distorsión del esquema corporal y disminuir la percepción de dolor, se ha probado la efectividad de una intervención basada en la rehabilitación de la agudeza táctil en un grupo de pacientes afectados de SFM. La mejora de la agudeza táctil registrada puede atribuirse a una reorganización de la corteza somatosensorial. Además, sugerimos que la modulación mutua entre el incremento de la agudeza exteroceptiva junto con la disminución de la sensibilidad interoceptiva, contribuye en la disminución de la percepción del dolor y del impacto de la patología.

This Ph.D. project involves the temporal sequence of the earliest functional and structural events in the striatal synapses in a rat model of progressive parkinsonism induced by overexpression of human ¿-synuclein (h¿-syn) with A53T mutation (rAAV-h¿-syn) in the substantia nigra compacta (SNc), before parkinsoniasn motor features appear. We have observed a sequential pattern of events. The aggregation of h¿-syn in the striatal dopaminergic terminals firstly induces deregulation of proteins affecting metabolism followed by decreased mitochondrial respiration in striatal synaptosomes. Differential analysis by proteomics revealed significant deregulated proteins from biological pathways related to synaptic function and neurotransmission. These functional and proteostatic alterations precede the structural changes and the onset of degeneration of the dopaminergic axons in the striatum that precede the loss of neuronal soma in the SNc. Lastly, homeostatic changes in glutamatergic synapses are simultaneous to the onset of the synaptic functional deficit, and dendritic spine loss is accompanied by plastic events. These last findings could represent compensatory mechanisms to maintain normal function during the onset of dopaminergic degeneration. We count with a good model of progressive synaptopathy in the dopaminergic pathway linked to the accumulation of h¿-syn, providing an excellent preclinical model to develop new synapse-targeted therapies.

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas letales causadas por la acumulación de la isoforma malplegada e infectiva (PrPSc) de la proteína priónica celular (PrPC) en el sistema nervioso central. La PrPSc es neurotóxica, insoluble, forma agregados y tiene la capacidad de inducir el malplegamiento a la PrPC nativa.Las EET afectan a diferentes mamíferos incluyendo a los humanos y, en la actualidad, no existe ningún tratamiento capaz de evitar, retrasar o curar la enfermedad. Por lo tanto, encontrar compuestos capaces de prevenir o ralentizar el inicio de la enfermedad, así como mitigar los signos clínicos de la enfermedad, es clave en el campo de los priones. Dada nuestra experiencia en la propagación priónica in vitro y en modelos de enfermedad priónica in vivo, tenemos la capacidad de probar diferentes compuestos con actividad antipriónica. Por otro lado, las porfírias son un grupo de enfermedades metabólicas, dentro de las cuales está la Porfiria Eritropoyética Congética, una enfermedad rara donde debido a una mutación en una enzima de la ruta metabólica del grupo hemo se acumula un metabolito de desecho llamado uroporfirina I. Este compuesto es un tetrapirrol, con gran similitud estructural con uno de los inhibidores de propagación priónica más efectivo descrito hasta la fecha. En esta tesis se evalúa la uroporfirina Icomo compuesto antipriónico, concluyendo que presenta gran capacidad de inhibición de la propagaciónpriónica in vitro, la facultad de retrasar el desarrollo de la enfermedad in vivo y una baja toxicidad.(No rebasar en extensión el presente recuadro)

A pesar de la evidencia epidemiológica de la existencia de un gran porcentaje de casos familiares de TE que sugieren que la etiología del TE tiene una base genética, las variantes identificadas hasta la fecha han tenido un bajo impacto, en cuanto a su volumen por lo que hay que considerar que un gran porcentaje de la heredabilidad del TE está todavía sin explicar.*Los trabajos realizados para esta tesis han estudiado este punto a partir de una encuesta epidemiológica de donde se extrajo una muestra clínica de casos familiares seleccionados y en la que se ha aplicado una robusta técnica de ultrasecuenciación masiva como es el WES (Secuenciación del Exoma Completo). Se pretendía además caracterizar la expresión fenotípica del temblor en cada una de las familias e identificar si existen rasgos clínicos comunes para cada una de las mutaciones/loci genéticos identificados, así como los límites fenotípicos de cada entidad molecular descubierta.* Los resultados permitieron cifrar la prevalencia global del Temblor Esencial en las personas mayores de 65 años de edad de nuestra población en el 4.8%. La prevalencia aumenta de forma significativa con la edad y no se encontraron diferencias en relación al sexo. Se ha identificado una mutación p.Trp26Stop en el gen ACMSD que segrega con la enfermedad en una familia con temblor mioclónico cortical y epilepsia. Este hallazgo apunta a que la vía de la kinurenina del metabolismo del triptófano estaría implicada en la patogénesis de esta entidad.Se han identificado dos mutaciones en familias con Temblor Esencial. La mutación p.Gly171Ala en el gen SORT1 que además de afectar a la expresión de su proteína codificante, sortilina, también afecta a los niveles de RNAm de su receptor, neurotrofina p75, que se conoce que está implicado en el daño cerebral, apoptosis y neurotransmisión GABAérgica inhibitoria en el SNC. La mutación p.Gly1537Ser en el gen SCN4A que produce una alteración en la cinética y en selectividad de la conducción de iones en el canal del sodio, facilitando la conductancia tanto del potasio como del amonio lo que podría contribuir al desarrollo del temblor y la epilepsia respectivamente. * La variabilidad fenotípica y genética observada en las familias estudiadas apoya la hipótesis que el temblor esencial, simple o complejo, no constituye una entidad única y que en su fisiopatología pueden estar implicados múltiples mecanismos tanto neurodegenerativos. Las tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS) y concretamente la secuenciación del exoma (WES) han demostrado una gran eficacia en el estudio de las correlaciones fenotipo-genotipo en familias concretas con presencia de varios miembros afectos y un patrón de segregación más o menos definido. Sin embargo, su rendimiento baja en los casos individuales consecuencia del gran número de variantes detectadas.

La demencia frontotemporal (DFT) segunda forma de demencia de inicio temprano tras la enfermedad de Alzheimer (EA) representa un grupo heterogéneo de trastornos que en los últimos años está experimentando extraordinarios avances en su conocimiento fisiopatológico. La identificación de características clínicas puede ayudar en la predicción de su patología molecular o de una determinada alteración genética, y ser objetivo de nuevos ensayos con fármacos dirigidos hacia dianas concretas.En este trabajo se ha realizado la caracterización fenotipo-genotipo de una cohorte de pacientes con sospecha clínica de DFT, llevándose a cabo un estudio multidisciplinar en el que se han analizado características demográficas, variabilidad clínica, conductual, neuropsicológica, anatomopatológica y genética, mediante la detección de mutaciones en los genes: MAPT, GRN, FUS, VCP, TARDBP,CHMP2By C9orf72.Se han tomado muestras de sangre de 74 pacientes y utilizando técnicas de secuenciación convencional se han detectado expansiones en el gen C9orf72 en 6 de estos pacientes y mediante la llamada Next Generation Sequencing (NGS) mutaciones en 6 pacientes en GRN, dos de ellas de significado clínico desconocido, 0 en MAPT, 2 pacientes con mutaciones en VCP y 3 en FUS, completándose el análisis en este caso con estudios de expresión del gen.DFT puede confundirse clínicamente con otras entidades como trastornos psiquiátricos y EA (22% de nuestras necropsias). Memoria y fluencia verbal son los dominios cognitivos más frecuentemente afectados en nuestros pacientes. El uso de biomarcadores resulta primordial para lograr más precisión diagnóstica. NGS abre una puerta al descubrimiento de nuevas mutaciones sin embargo el manejo e interpretación de las variantes de significado incierto supone un proceso complejo.

En este trabajo de tesis doctoral se ha analizado como la delección genética de un receptor afecta al resto del sistema con el que interactúa. Más concretamente, se ha establecido cuáles han sido los cambios en el sistema endocannabinoide del hipocampo, en la capa molecular del giro dentado, tras la eliminación completa del receptor TRPV1 (ratones TRPV1-KO).Se ha analizado tanto la expresión de las enzimas relacionadas con la síntesis y degradación de endocannabinoides, la expresión de proteínas relacionadas con la funcionalidad del receptor CB1R y la expresión del propio receptor CB1R mediante inmunohistoquimia y western blot. También se ha analizado la redistribución a nivel ultra-estructural del receptor CB1R en neuronas como en astrocitos y en orgánulos celulares como la mitocondria en los ratones TRPV1-KO. Junto con ello, se ha analizado la plasticidad a largo plazo que presentan estos ratones en la capa molecular del giro dentado, subdivido en las tres capas que lo conforman. Además, se ha evaluado la memoria tanto de reconocimiento como espacial de estos ratones para ver si los cambios observados a nivel de expresión y redistribución, así como los cambios observados en la plasticidad sináptica, podían tener repercusión en las funcionesnormalmente atribuidas al hipocampo.Por último, se ha evaluado si las alteraciones que presentan estos ratones podría tener alguna implicación en una situación patológica, en este caso se evaluó la respuesta de los TRPV1-KO frente a convulsiones producidas por kainato.Los cambios observados en cuanto a la expresión de proteínas relacionas con el sistema endocannabinoide (aumento en unas y descenso en otras), la expresión aumentada del receptor CB1 en neuronas glutamatergicas y reducida en gabaergicas, los cambios en la eficiencia de acoplamiento y los cambios en la plasticidad sináptica no afectaron a las memorias evaluadas de los ratones pero sí que supusieron un mejoramiento frente a las convulsiones producidas por el kainato.

La enfermedad de Parkinson (EP) se caracteriza por un déficit de dopamina en el estriado debido a la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta (SNpc) que proyectan al estriado. El marcador histopatológico de la EP es la presencia de inclusiones citoplasmáticas, que contienen agregados de ¿-sinucleína (¿-sin) denominados cuerpos de Lewy, en la SNpc y en otras estructuras cerebrales. Diversos mecanismos se han implicado en la etiopatogenia y progresión de la EP, entre los que la neuroinflamación y activación glial han cobrado gran relevancia. Estudios post mortem en pacientes con EP y en modelos animales con lesión dopaminérgica aguda (rata 6-OHDA y mono MPTP) muestran numerosas evidencias de activación microglial, tanto en la SNpc como en el estriado, que a su vez se asocian con muerte dopaminérgica, por lo que existe una gran interacción entre estos fenómenos. Sin embargo, ni los estudios humanos ni los modelos animales empleados hasta el momento han permitido dilucidar si la microglía y los astrocitos participan en la iniciación/progreso o su activación es consecuencia de la muerte dopaminérgica. Esto se debe a que los trabajos existentes están realizados en sistemas dopaminérgicos con lesión establecida y muy extensa. En este trabajo estudiaremos la relación entre el proceso de neuroinflamación y la muerte neuronal dopaminérgica en un modelo animal de parkinsonismo progresivo en el que se evaluará in vivo (estudios de tomografía por emisión de positrones) la activación microglial, y post mortem marcadores moleculares de neuroinflamación y lesión dopaminérgica. Así, usando un modelo de sobreexpresión de ¿-sin humana mutada A53T en la SNpc de rata, se definirá la relación temporal entre lesión nigroestriatal y activación microglial.

INTRODUCCIÓN: En los últimos años han aparecido investigaciones de índole cuantitativa que evalúan la efectividad de la Terapia Dialéctica Conductual (TDC) en adolescentes con problemas de impulsividad y/o desregulación emocional con resultados alentadores. Sin embargo, no existen investigaciones de índole cualitativa en población adolescente que evalúen dicha herramienta psicoterapéutica.HIPÓTESIS Y OBJETIVOS: Conocer la experiencia subjetiva de los adolescentes con diagnóstico de Trastorno de Conducta que han participado en el grupo de formación en habilidades psicosociales según el modelo de Terapia Dialéctica Conductual, así como extraer a partir de dicha experiencia hipótesis sobre su utilidad que puedan ser verificadas en un futuro mediante instrumentos cuantitativos.METODOLOGÍA: Análisis cualitativo a través de grupos focales con el fin de conocer datos que no se han recogido por escalas cuantitativas sobre la experiencia subjetiva de los pacientes con problemas de conducta que han realizado la formación en habilidades psicosociales según el modelo de Terapia Dialéctica Conductual.RESULTADOS: Se obtiene la experiencia subjetiva de los adolescentes que han completado el entrenamiento en habilidades psicosociales (TDC) en cuatro grandes categorías: experiencia de enfermedad, motivación para la terapia, experiencia de la terapia y resultados de la terapia.CONCLUSIONES: Los adolescentes con problemas de conducta valoran de forma positiva su participación en el grupo de entrenamiento en habilidades psicosociales (TDC), más allá del aprendizaje de habilidades, subrayan los cambios intrapsíquicos que objetivan tras dicha experiencia grupal.

Las Benzodiacepinas/Z son unos fármacos ampliamente utilizados en la población anciana. Las pautas de prescripción no siempre se adecúan a las recomendaciones de las guías clínicas publicadas. Las consecuencias derivadas pueden tener implicaciones no sólo en la calidad de vida de los pacientes sino también en el coste económico para el sistema de salud. En el trabajo de la tesis se realiza una revisión sistemática de la bibliografía publicada en la que se relacione el uso de BZD/Z en esta población con las caídas. Igualmente se evalúa el consumo de estos fármacos en una muestra de ancianos que acuden a los servicios de urgencias del Hospital Universitario de Álava, se evalúa la adecuación de las dosis, las diferencias de género en las prescripciones y se analizan las consecuencias para el paciente y el gasto asociado para el sistema de salud derivados de las caídas sufridas por los ancianos que se encuentran sobredosificados.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad degenerativa de las motoneuronas que produce un debilitamiento muscular gradual hasta ocasionar parálisis y muerte mientras el paciente es consciente de esta progresión. Una combinación de factores genéticos que predisponen a una peor utilización de recursos energéticos, junto con factores ambientales que aumentan la demanda energética, podrían inducir un desequilibrio en la homeostasis energética y una consecuente adaptación hipercatabólica orgánica. El músculo es el principal tejido regulador del metabolismo global y la adaptación metabólica en caso de alguna deficiencia muscular. Por ello, en este trabajo se considera al músculo como posible tejido afectado en la ELA con independencia de la motoneurona y se ha realizado un estudio exhaustivo de los mecanismos moleculares sobre atrofia muscular y el proceso de miogénesis en los mioblastos silenciados con los genes TARDP43, SOD1 y FUS relacionados con la Esclerosis Lateral Amiotrófica. Asimismo, se ha encontrado una posible diana a tratar que puede revertir las deficiencias metabólicas que subyacen a la deficiencia en el proceso de miogénesis encontrados tanto en mioblastos silenciados como en mioblastos primarios de pacientes. El tratamiento inhitorio de dicha diana, rescata en gran medida el fenotipo metabolico y miogénico que la perdida de función de los genes ocasiona.

El cáncer colorrectal representa un grave problema de salud pública por su incidencia, prevalencia y mortalidad. Los programas de cribado son necesarios para el diagnóstico precoz pero aún no han conseguido reducir sustancialmente la incidencia y mortalidad además de ser poco precisos para seleccionar población diana candidata a colonoscopia. La incorporación de marcadores basados en la ómica podría mejorar dicha carencia. Se ha realizado un estudio con 25 pólipos (adenomas vellosos, túbulo vellosos, tubulares, con adenocarcinoma pT1 y lesiones serradas) comparando con tejido sano alejado para determinar los valores de cuantificación de las proteínas (1916), seleccionas por proteómica del descubrimiento y dirigida, así como de metabolitos (carnitinas, acilcarnitinas y aminoácidos) y la posibilidad de predecir si la lesión es precoz o tardía (adenocarcinoma) o de extensión lateral. Se realizó análisis estadístico XLstat y pruebas de normalización de lo datos, tras lo cual se clasificaron los clústeres de proteínas y se analizaron por componentes principales, clusterización aglomerativa y K medias con enriquecimiento funcional. Además, se ha determinada la sensibilidad, especificidad, área bajo la curva y precisión junto a modelos predictivos. Se identificaron proteínas con mayor expresión diferencial en subtipos histopatológicos concretos, proteínas que participan en la extensión lateral y otras con aplicación clínica directa. También se han determinados metabolitos (carnitinas, acilcarnitinas y aminoácidos) como futuros biomarcadores de lesiones en fase precoz y tardía.Esta estrategia aporta un avance en la estrategia de cribado del cáncer colorrectal y la vigilancia de pólipos derivada de ella para seleccionar de forma más eficiente a los pacientes y optimizar las colonoscopias.

En la presente tesis se han analizado por un lado el desarrollo, formación y establecimiento de las células madre neurales adultas del hipocampo en la zona subgranular del giro dentado, y por otro la respuesta de ésta población en una situación patológica como la epilepsia del lóbulo temporal medial.Nuestro trabajo ha conseguido esclarecer que en el ratón las células madre neurales adultas son generadas después del nacimiento mediante división celular dependiente de ciclina D2 y se produce en el interior del giro dentado, sugiriendo la formación de una población nueva y completamente diferenciada de las células madre que generan las poblaciones neuronales del hipocampo durante el desarrollo.Por otro lado, hemos descubierto que tanto el factor de crecimiento epidermal como el zinc son actores principales que intervienen en la respuesta inicial de las células madre tras un episodio de convulsión epiléptica. Así, el bloqueo del factor de crecimiento epidermal mediante el tratamiento intranasal con Gefitinib ayuda a la protección de las células madre y su capacidad neurogénica, notablemente reducida tras convulsiones en ratones no tratados.

Cancer cells can develop a strong addiction to discrete molecular regulators, which control the aberranttranscription programs that drive and maintain the cancer phenotype. Here, we report the identificationof the RNA-binding protein HuR as a central oncogenic driver for malignant peripheral nerve sheathtumours (MPNSTs), which are highly aggressive sarcomas. We show HuR was bound to a multitude ofcancer-associated transcripts in human MPNST samples. Accordingly, genetic and pharmacologicalinhibition of HuR had potent cytostatic and cytotoxic effects on tumour growth, and strongly supressedmetastatic capacity in vivo. Importantly, we linked the profound tumorigenic function of HuR to itsability to simultaneously regulate multiple essential oncogenic pathways in MPNST cellls, including theWnt/ß-Catenin, YAP/TAZ, Rb-E2F and BET proteins, which converge on key transcriptional networks.Regulating survival, proliferation, and dissemination. Therefore, we propose HuR represents an idealtherapeutic target for MPNST treatment. Peripheral nervous system involvement has also beenobserved in Lyme disease-assicated clinical manifestations, which is the most common arthropod-borneinfectious disease in temperate regions. It is caused by infection with the spirochete Borreliaburgdorferi, which is transmitted by a tick bite. Here, we identified Schwann cells as the new targets ofB. burgdorferi, leading to demyelination in the absence of immune cells. We suggest that B. burgdorferiregulates intracellular signaling pathways, including Wnt/ß-Catenin, to strongly repress myelin gene andprotein expression, throwing light on one of the most intriguing pathological features of Lyme disease.

Las enfermedades cardiovasculares (CV) son una de las causas más importantes de discapacidad y muerte prematura en todo el mundo. Una de las causas subyacentes de las CV es la aterosclerosis. La aterosclerosis de carótida se caracteriza por el desarrollo de una placa de ateroma, la cual puede producir oclusión del vaso sangúineo, causando una esquemia cerebral o ictus. La formación de estas placas está fuertemente influenciada por las células de músculo liso (CML) que se encuentran en la pared arterial y que participan tanto en la formación como ruptura de la placa (y posterior isquemia) gracias a la plasticidad fenotípica que retienen. Sin embargo, a día de hoy, no se conoce el rol exacto de las CML en la aterosclerosis, ni tampoco el mecanismo de rutpura de la placa. Por ello, con el objetivo de buscar un biomarcador que identifique una placa con altas probabilidades de romperese, y así, poder evitar el ictus., se ha realizado la caracterización y secuenciación del tansciptoma completo de las CML de placas de ateroma carotideas provenientes de pacientes sintomáticos (han sufrido un ictus) y asintomáticos (sin ningún síntoma). Se ha conseguido definir varios roles para las CML: por un lado, se ha asociado la senescencia celular a un tipo de placa inestable (propensa a romperse), mientras que la calcificación es más frecuente en placas estables (sin ruptura). Además, se han detectado varias moléculas (BMP2, ID1 e ID4) de alto interés pronóstico.

El trabajo se centra en la determinación de subgrupos clínicos en una enfermedad neurológica como el Síndrome de Fatiga Crónica/Encefalomielitis Miálgica (CIE-11: 8E49), y el establecimiento tras análisis de un protocolo para su estudio. Como objetivo general: proponer una batería de pruebas sencillas pero suficientes para identificar la enfermedad y sus subgrupos clínicos.(

muscular más común, después de la distrofia de Duchenne y la distrofia miotónica, (Padberg, 1982) cuya prevalencia se estima en 1:20.000 habitantes.El patrón de debilidad muscular es bastante característico y afecta a la musculatura facial y los músculos fijadores de la escápula, con un grado de afectación variable de la musculatura de brazos, tronco y extremidades inferiores (Fitzsimons y cols., 1999). Esta afectación es en general muy asimétrica y éste es un rasgo distintivo muy útil para diferenciarla de otros síndromes escapulohumerales o escapuloperoneales. El síntoma inicial más común es la dificultad para levantar los brazos por encima de la horizontal que aparece generalmente en la adolescencia o en los adultos jóvenes.La DFEH1 es una enfermedad que se hereda de forma autosómico dominante y que presenta una penetrancia alta, con más de un 95% de individuos portadores del defecto genético mostrando síntomas de la enfermedad a los 20 años (Lunt y cols., 2000). El comienzo de la enfermedad y la expresión fenotípica es extremadamente variable, tanto intra como interfamiliar (Lunt y cols., 1995; Padberg y cols., 1995b) y existen tanto casos familiares como esporádicos (10-30%). Estos pacientes sufren una deleción del número de repeticiones en tándem denominadas D4Z4 de 3,3 kilobases (kb) dentro de un fragmento polimórfico EcoRI localizado en el locus 4q35. Un individuo control tiene más de 10 repeticiones o 38 kb y un individuo con DFEH1 tiene menos de 10 repeticiones o 38 kb. Dentro de cada una de las repeticiones se encuentra un gen denominado DUX4 que en estado adulto se encuentra reprimido. Cuando esta deleción de repeticiones se da en un entorno cromosómico ¿permisivo¿, se produce hipometilación en esa región y el gen DUX4 de la última de las repeticiones se estabiliza y se transcribe siendo esto tóxico para el músculo.Existe un 5% de pacientes clínicamente indistinguibles de los DFEH1 que son independientes de la contracción de repeticiones. En estos pacientes se producen mutaciones en genes modificadores de la cromatina que se encuentran reprimiendo físicamente el locus 4q35, aunque uno se encuentre en el cromosoma 18 (SMCHD1) y otro en el cromosoma 20 (DNMT3B), su función represora falla, se produce una hipometilación mucho más marcada que en los DFEH1, cuya consecuencia es la misma, la expresión del gen DUX4.En el locus 10q26 existe un fragmento polimórfico EcoRI que es homólogo en un 98% al del locus 4q35 pero que no es patológico. A la hora del diagnóstico molecular este hecho y la misma patofisiología peculiar de la enfermedad nos plantea una serie de problemas técnicos que debemos solventar (fragmentos homogéneos translocados entre 4q35 y 10q26, fragmentos híbridos, mosaicismo, deleción de la región de la sonda utilizada en el diagnóstico, individuos con fragmentos próximos al límite patológico, etc).Llevamos 20 años siendo centro de referencia en España para este tipo de distrofia muscular y tenemos una serie muy amplia de pacientes estudiados (más de 4.000) por lo que el objetivo de esta tesis es caracterizar tanto clínica como molecularmente a la población española con DFEH1, DFEH2 y con DFEH1+DFEH2, a la vez que aportar todos los datos observados dentro de los eventos ¿peculiares¿ que hemos comentado antes y establecer un algoritmo diagnóstico de trabajo diferente dependiendo del caso clínico que se presente.

La corteza cerebelosa experimenta profundos cambios morfológicos y moleculares durante el período postnatal. La morfogénesis de las células granulares (CG) es uno de ellos e implica todos los procesos neuronales del desarrollo. Existen evidencias de la participación del sistema endocannabinoide (SEC) en los procesos del desarrollo. Además, se conoce que tanto el receptor CB1 como los enzimas de síntesis y degradación del eCB 2-AG, el DAGL-¿ y MAGL, respectivamente, están presentes en la corteza cerebelosa en la segunda semana postnatal; sin embargo, se desconoce su localización específica en las edades más tempranas. Nuestros resultados obtenidos mediante técnicas inmunohistoquímicas para microscopía convencional y microscopía electrónica, demuestran la presencia de estos tres integrantes del SEC en los días postnatales 0 (P0), P5, P12 en los procesos axónicos de las fibras paralelas (FP) de las CG en la capa granular externa y la capa molecular, sugiriendo su participación en los procesos del desarrollo neuronal acaecidos en esa franja del desarrollo postnatal. Habida cuenta de la participación del SEC en el desarrollo, quisimos determinar si la ausencia del mismo podría tener algún impacto en las características fenotípicas típicas de las terminales de las FP (TFP) en los animales adultos que carecen del gen para CB1. Para ellos, estudiamos diversos parámetros ultraestructurales de las sinapsis TFP-células de Purkinje. Centramos el estudio en los lóbulos 5 y 10 de los ratones adultos CB1-WT y CB1-KO debido a la distinta sensibilidad que presentan al daño en situaciones patológicas y, por tanto, la ausencia del receptor CB1 podría tener consecuencias diferentes. Demostramos que existen diferencias evidentes, centradas en la arquitectura presináptica en estas sinapsis. Demostramos además, que la distinta sensibilidad descrita para las divisiones cerebelosas estudiadas tiene una base anatómica ultraestructural.

La depresión reprenta una enfermedad de alta y creciente prevalencia, crónica, discapacitante y con elevados costos tanto en el ámbito farmacéutico como en el de la atención médica y social.Una de las nuevas vías de investigación en los últimos años en diversos trastornos psiquiátricos y neurológicos y, concretamente, en la depresión es la teoría inflamatoria. La teoría inflamatoria postula que una inflamación crónica de bajo grado puede suponer un mecanismo etiopatogénico en la depresión. En esta tesis se han comparado los niveles plasmáticos de diferentes factores implicados en los mecanismos inflamatorios de un grupo de 59 casos con otro de 89 controles sanos y se han estudiado asimismo los cambios longitudinales de dichos factores en el grupo de los casos durante un año. Se ha buscado detectar si alguno de ellos podría servir como marcador de lapresencia de la enfermedad o como indicador de la respuesta al tratamiento y también la presencia de comorbilidad con otras enfermedades en las que también interviene un componente inflamatorio como las enfermedades cardiovasculares o la diabetes tipo II entre los sujetos con depresión. Los resultados conformaron la existencia de hiperactividad del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal en los pacientes con depresión expresado a través de una elevación de los niveles plasmáticos de cortisol y ACTH. Se hallaron más elevados en los pacientes algunos marcadores inflamatorios como la proteína C reactriva (PCR), la proteína S-100B y el enzima indolamina 2,3 dioxigenasa (IDO) y disminuidos los niveles de colesterol-HDL, mientras que otros indicadores inflamatorios como las citocinas IL-1a, IL-6, TNF-a y de neuroplasticidad como el factor BDNF no presentaron alteraciones plasmáticas en estos pacientes. Según los resultados los factores que mejor predicen la presencia de depresión son la existencia de enfermedad cardiovascular previa, los niveles de colesterol-HDL, los niveles de ACTH y los niveles de proteína S-100-B. En el seguimiento longitudinal a 12 meses, la elevación de los niveles plasmáticos de cortisol, ACTH, PCR, S-100B e IDO no sufrió modificaciones a pesar de la respuesta clínica de los pacientes al tratamiento antidepresivo mientras que la disminución de los niveles plasmáticos de colesterol-HDL tendió a desaparecer en paralelo a la respuesta clínica de los pacientes al tratamiento antidepresivo. De manera general, el exceso de actividad inflamatoria en plasma de pacientes con depresión parece matenenerse elevado independientemente del grado de respuesta clínica y altuna alteración del metabolismo, como la disminución del colesterol-HDL, parece conllevar un mayor nivel de actividad inflamatoria en plasma y asociarse, de manera directa o indirecta, a la presencia de depresión.

El objetivo general de esta tesis es ampliar el conocimiento sobre la fisiopatología de la EA e investigar la posible interrelación existente entre tres hechos biológicos cerebrales que podrían estar involucrados en los mecanismos patológicos de la EA. Estos hechos fisiopatológicos se refieren a cambios en la homeostasis del colesterol, la microestructura de la SB y la amiloidogénesis.En el Capítulo 2 el objetivo es analizar si el metabolismo lipídico sistémico está involucrado con cambios en la microestructura de la SB. Se realiza un estudio transversal para analizar si la variabilidad interindividual de los niveles plasmáticos de colesterol total (CTOT), lipoproteínas de colesterol de alta densidad (HDL), lipoproteínas de colesterol de baja densidad colesterol (LDL) y triglicéridos (TG) se asocia a la variabilidad en la microestructura de la SB de las regiones relacionadas con la cognición, en sujetos sanos. La hipótesis es que los valores altos de HDL se relacionan con los valores altos de FA y AxD e inferiores de MD y RD y que por el contrario los valores altos de los TG, LDL y CTOT se asocian con niveles inferiores de FA y AxD y superiores de MD y RD. También se plantea la hipótesis de que estasasociaciones estarían influidas por el genotipo APOE, la presión arterial o el uso de las estatinas. Además, se examina también si la posible asociación entre los lípidos plasmáticos y la difusividad axial está relacionada con la pérdida axonal, medida a través de los niveles de NfL en LCR.En el Capítulo 3 el objetivo es entender mejor la relación entre el metabolismo del colesterol cerebral, concretamente sus oxiesteroles, la microestructura de la SB y los biomarcadores de EA en LCR, especialmente en regiones relacionadas con la cognición. Este estudio se centra en los dos principales oxiesteroles sintetizados enzimáticamente, 24-hidroxicolesterol (24-OHC) y 27-hidroxicolesterol (27-OHC); y en otros dos sintetizados no-enzimáticamente en condiciones de estrés oxidativo, 7ß-hidroxicolesterol (7ß-OHC) y 7-cetocolesterol (7-KC). Para ello se realiza primero un estudio transversal para determinar si los metabolitos del colesterol afectan a la microestructura de la SB y si se asocian a los niveles de ßA1-42, t-tau y p-tau en LCR. Después se investiga si los niveles basales de los metabolitos del colesterol y los índices de difusión en la resonancia magnética determinan posibles cambios longitudinales de los biomarcadores de EA. La hipótesis es que la variabilidad interindividual de los niveles de los oxiesteroles en LCR se relaciona con los cambios en los índices de la DTI y se asocia a niveles inferiores de ßA1-42 y/o superiores de t-tau o p-tau. Además, para investigar el posible papel de la inflamación y el daño axonal, también se han estudiado biomarcadores como el YKL-40 y el neurofilamento de cadena ligera (NfL).Con el objetivo futuro de analizar las posibles diferencias en los patrones lipidómicos en el LCR entre pacientes con DCL y personas sanas, en el Capítulo 4 se comparan dos métodos de preparación de muestras para el análisis de lípidos en LCR mediante cromatografía líquida de alto rendimiento-espectrometría de masas (UHPLC-MS). Uno es un método de precipitación de proteínas que utiliza el isopropanol (IPA) como disolvente orgánico y el otro es una extracción líquido-líquido de lípidos con una mezcla de cloroformo-metanol (CHCl3-MeOH). Mediante un conjunto de criterios de simplicidad, cobertura lipídica, reproducibilidad y recuperación, el objetivo de este estudio es identificar cuál de estos dos métodos es el más robusto y eficiente para utilizar el LCR en la elaboración de perfiles de lípidos a gran escala en trastornos neurológicos. Como resultado de este trabajo se han aportado datos sobre el perfil lipidómico del LCR de individuos sanos.El último capítulo de esta tesis, Capítulo 5, es la discusión general, donde se resumen todos los hallazgos y se discuten las implicaciones de los resultados y las posibles investigaciones futuras.

La presente tesis se ha centrado en el estudio de los mecanismos fisiopatológicos del trastorno de control de impulsos (TCI) en pacientes con enfermedad de Parkinson (EP). El TCI es una complicación relevante ya que es frecuente y grave en muchas ocasiones, comportando una elevada disrupción de la vida del paciente y su entorno que puede llevar hasta al suicidio en los casos más graves. A pesar de las importantes repercusiones, sus mecanismos fisiopatológicos son desconocidos, habiéndose descrito resultados contradictorios a múltiples niveles de estudio, pero especialmente en los estudios de imagen. Esta tesis se ha realizado no sólo con el ánimo de comprender los mecanismos por los que ocurre, sino también con el objetivo de ampliar las herramientas de detección de los sujetos que serán más sensibles al desarrollo de esta complicación tras el inicio de la terapia de reposición dopaminérgica. Por este motivo, se ha realizado en estos pacientes una aproximación multimodal de neuroimagen desde diversas técnicas, con el objetivo de entender la interacción entre el impacto de la degeneración dopaminérgica y elreemplazo terapéutico en aspectos críticos del comportamiento humano, contribuyendo a delinear los posibles correlatos neurales relacionados con esta complicación en los pacientes con EP. El hecho de investigar y profundizar en los circuitos cerebrales que se encuentran alterados en este tipo de pacientes, podría abrir una puerta a la hora de tratar esta complicación una vez establecida, quizá fundamentando las bases de la terapia con ECP con electrodos direccionales y otros tratamientos focalizados en áreas pertenecientes al circuito límbico. Este trabajo también contribuiría al descubrimiento de biomarcadores de neuroimagen que pudiesen identificar pacientes con EP susceptibles de desarrollar un TCI, con el objetivo de su prevención evitando terapias con agonistas dopaminérgicos en dichos casos. Esta tesis se divide en tres subapartados en las que en (i) el primero estudiamos el patrón de denervación dopaminérgica de estos pacientes así como su asociación con el metabolismo cerebral y con diferentes características clínicas y cognitivas. Esto ha dado lugar a un artículo ya publicado en Eur J Nucl Med Mol Imaging. (ii) En segundo lugar se ha investigado la conectividad funcional dinámica en la Resonancia Magnética funcional en reposo en estos pacientes así como las propiedades topológicas de la misma mediante un análisis de teoría de grafos. Este artículo está actualmente en revisión por la revista Parkinsonism and related disorders journal. (iii) Por último en estos pacientes se ha estudiado la activación cerebral, el curso temporal de la misma y la mediación de la conectividad funcional mientras estos pacientes se enfrentaban en la Resonancia Magnética funcional al Juego de Azar de Iowa, una tarea de toma de decisiones y de control inhibitorio.Resumiendo los resultados: el estudio de la denervación dopaminérgica estriatal, muestra en estos pacientes una denervación dopaminérgica en el estriado ventral característica, paralela a la gravedad de su sintomatología y en asociación directa con una disminución de metabolismo cerebral en áreas pertenecientes al sistema mesocorticolimbico en reposo. Además se ha estudiado por primera vez la dinámica de la conectividad funcional también en reposo, en la que se aprecia que las alteraciones de estos pacientes exceden una disfunción en regiones cerebrales localizadas y se extienden a nivel de la comunicación entre redes, presentando una tendencia a mostrar un aumento de la conectividad funcional a nivel local en áreas concretas que intervienen en la evaluación del estímulo a expensas de una tendencia a reducir la conectividad a larga distancia. Este aumento del mantenimiento en este patrón de conectividad concreto, se asocia en estos pacientes tanto al aumento de impulsividad como a la mayor búsqueda de novedad como rasgo de personalidad del sujeto. De la misma manera, el estudio de las propiedades topológicas de estas alteraciones en la conectividad de estos pacientes, nos muestra una elevada eficiencia local en la comunicación entre estas áreas. Estos resultados nos muestran patrones específicos de estos pacientes en reposo, tanto a nivel molecular como de Resonancia Magnética funcional, que se hacen más patentes conforme se acentúa la gravedad del TCI, los cuales podrían plantearse como biomarcadores de imagen de pacientes expuestos al desarrollo de esta complicación. Por último, al enfrentar a estos sujetos a una tarea de toma de decisiones y control inhibitorio, se aprecia una mayor activación de las áreas implicadas tanto en procesos de recompensa como de inhibición. Esto puede traducir la disfunción regional evidenciada previamente en el estudio metabólico desde la otra cara de la moneda, en la que se apreciaría un aumento de activación como reflejo de un posible mecanismo compensatorio para controlar las elecciones de riesgo. Además en estos pacientes se constata una respuesta de activación más precoz, que podría ser el reflejo de la predicción inicial de errores y la asignación de relevancia que precede a la toma de decisiones. Hay que destacar, que en esta tesis se enfatiza el estriado ventral como estructura clave que lleva a la disfunción de otras áreas pertenecientes al circuito mesocorticolímbico en paralelo a un aumento del desarrollo y gravedad del TCI en pacientes con EP. Además, se describe por primera vez la implicación del núcleo subtalámico derecho en una tarea de impulsividad cognitiva y la exclusividad de esta implicación en pacientes con EP y TCI, lo cual podría tener relevancia clínica en el marco terapeútico de la modulación conductual mediante estimulación cerebral profunda del núcleo subtalámico.

El trabajo se centra en el estudio de la eficacia de antinflamatorios en modelos animales de depresión como acercamiento a la investigación traslacional en su posible aplicación como intervención terapéutica en depresión. Se ha realizado una revisión sistemática y meta-análisis de toda la evidencia disponible, para poder esclarecer la hipótesis que defiende el papel decisivo de la inflamación en el desarrollo de la depresión como causa de una exposición crónica a estresores sociales. Se ha evaluado la posible eficacia de antinflamatorios en los diferentes modelos animales de depresión para poder entender mejor, aspectos de su fisiopatología. Este trabajo es relevante ya que la depresión es una de las enfermedades más comunes del mundo, siendo la cuarta causa principal de discapacidad. Los enfoques terapéuticos actuales no son del todo eficaces ya que,muchos de los individuos que la padecen nunca reciben diagnóstico o tratamiento, y sólo el 30-35% de los adultos logran la remisión. A raíz de esto, la probabilidad de recurrencia después de 10 años es del 67% y después de 15 años es del 85%. Es posible, que la revisión de la eficacia de antinflamatorios en modelos animales de depresión sirva para potenciar la investigación traslacional y aporte información relevante sobre los problemas metodológicos relacionados con revisiones sistemáticas de la eficacia de intervenciones en modelos animales de enfermedades.

The present Thesis focuses on the description of new subcellular localizations of CB1 receptors in normal brain and the study of the CB1 receptor expression in certain pathophysiological states. Different histological techniques have been crucial in defining the CB1 receptor expression and localization at the cellular level. However, it is extremely difficult to identify the subcellular distribution of CB1 receptors in some cell-types due to its low expression level on those cells. Moreover, it remains a key question to know the pattern of the subcellular CB1 receptor expression and distribution under pathological states. The high resolution immunoelectron microscopy applied in this study has shown to be an excellent approach for the fine detection of CB1 receptors in the brain. In particular, the single pre-embedding immunogold method for electron microscopy based on the use of specific primary CB1 receptor antibodies and silver-intensified 1.4 nm gold-labeled Fab' fragments was used, as well as the combined pre-embedding immunogold and immunoperoxidase method that implied the additional use of biotinylated secondary antibodies and avidin-biotin complex for the simultaneous localization of CB1 receptors and protein markers of specific brain cells or synapses.

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neurodegenerativa y autoinmune que a día de hoy no tiene cura. Se trata de una patología compleja que surge por una combinación de factores genéticos y ambientales. El objetivo de esta tesis es el estudio del gen ANKRD55, considerado de riesgo para la EM, así como de su correspondiente proteína. En el estudio genético se analizó el efecto de varios polimorfismos (SNPs) de ANKRD55 sobre la expresión génica. Se observaron efectos opuestos en linfocitos T CD4+ y células dendríticas derivadas de monocitos de pacientes y donantes sanos. Por otro lado, se caracterizó el interactoma proteico de ANKRD55 en cuatro líneas celulares, inmunes y neurológicas, de importancia en la patología de la EM. Entre los resultados, se identificaron proteínas de la familia 14-3-3 unidas a ANKRD55 en todos los tipos celulares analizados, y proteínas del transporte intraflagelar en la línea de microglía. Los posteriores análisis bioinformáticos, basados en los resultados experimentales, revelaron la potencial implicación de ANKRD55 en diversos mecanismos biológicos y moleculares como la sinapsis neuroinmune y la regulación del ciclo celular. Los resultados de estas tesis aumentan el conocimiento sobre el locus genético de ANKRD55 asociado a la EM y su posible función.

La violencia auto o heterodirigida en salud mental es un problema para el sistema sanitario no por su frecuencia sino por la gravedad de sus posibles consecuencias para el paciente y/o su entorno. Se considera necesario resumir la evidencia disponible en relación a las intervenciones no farmacológicas en el manejo de la violencia auto y heterodirigida en personas con trastorno mental grave y por ello, como primer paso, se llevó a cabo una revisión exploratoria y posteriormente, se llevó a cabo una revisión global rápida. En la revisión exploratoria, fueron incluidos 19 estudios primarios (28 artículos) y en la revisión global rápida se incluyeron 17 revisiones sistemáticas. Se encontró varias intervenciones no farmacológicas que mostraron un efecto positivo en la violencia auto y heterodirigida en personas con trastorno mental grave.

La isoforma malplegada (PrPSc) de la proteína del prion celular (PrPC), es el agente causal de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET), un conjunto de desórdenes neurodegenerativos mortales que afectan a distintos mamíferos incluidos los humanos. La conversión espontánea de PrPC a PrPSc es la causa de enfermedad menos comprendida y la más relevante, desencadenando las EET esporádicas, que comprenden la mayoría de los casos en humanos. Sin embargo, su baja incidencia entre la población, su heretorgeneidad y la dificultad de replicarlas en modelos animales limita su estudio. En esta tesis doctoral, basándonos en la metodología de propagación priónica in vitro PMSA, y tras la modificación de algunos parámetros fundamentales, se han obtenido espontáneamente distintas isoformas de PrP recombinantes murinas malplegadas que presentan el comportamiento de un prion bona fide, siendo resistentes a la digestión con proteasas, auto-propagables e infecciosas in vivo. Durante el proceso, se identificaron potenciales confórmeros que fueron caracterizados bioquímica y biológicamente para confirmar la obtención de diferentes cepas priónicas, modelando la heterogeneidad del malplegamiento espontáneo. La PMSA permitió el estudio de la cinética del proceso de malplegamiento espontáneo de la PrP murina, metodología que se reprodujo con éxito al utilizar PrP recombinante ovina, sugiriendo el potencial de esta técnica in vitro para la formación de priones espontáneos de otras especies. Queda demostrado que esta técnica es idónea para la generación espontánea de priones recombinantes in vitro, permitiendo estudiar el fenómeno de formación de cepas y proporcionando modelos de gran interés para la comprensión de las EET esporádicas.

La función reflexiva (FR) es la habilidad para entenderse a sí mismo o a los demás en términos de estados mentales intencionales. Sus fallos se han vinculado a distintos trastornos mentales y las intervenciones que la mejoran han demostrado ser terapéuticas. La FR de los padres influye en el apego de sus hijos. El Reflective Functioning Quetionnaire (RFQ8) ha sido ampliamente utilizado en la evaluación de la FR. Incluye una escala de incertidumbre (RFQi) y otra de certidumbre (RFQc). No existen instrumentos que midan la FR general en población española. El objetivo del estudio es desarrollar una versión española del RFQ y evaluarla psicométricamente en población general y trastornos de personalidad (TP). Metodología: 602 participantes no clínicos y 41 con TP completaron una traducción española del RFQ y una batería de cuestionarios autoaplicados evaluando constructos relacionados con la mentalización (alexitimia, toma de perspectiva, difusión de identidad y mindfulness), psicopatología general y específica, y problemas interpersonales. Se evaluó la estabilidad temporal en una submuestra no clínica de 113 participantes. Resultados: En el análisis factorial exploratorio un modelo bifactorial explicó el 53,02% de la varianza. El análisis factorial confirmatorio sugirió un modelo de dos factores, aunque la RFQi solo ajustó parcialmente al modelo. Ambas escalas mostraron buena consistencia interna en ambas muestras y una estabilidad temporal adecuada. La RFQi correlacionó significativamente con difusión de identidad, alexitimia, mindfulness, toma de perspectiva y psicopatología general. La RFQc mostro correlaciones inversas y también correlacionó con problemas intepersonales. Ambas escalas diferenciaron entre grupos conocidos, incluidos el grupo clínico y el no clínico. Discusión: Se proporciona la primera evidencia de una adecuada fiabilidad y validez de la versión española del RFQ en población general y TP.

This Ph.D. project is focused on the characterization of pathological events in the hippocampus, which could be related to non-motor manifestation in Parkinson¿s disease such as behavioral and memory impairments. For that purpose, we have studied the temporal sequence of functional and structural changes in the hippocampus in a rat model of progressive parkinsonism induced by the overexpression of human ¿-synuclein (h¿-syn) with the A53T mutation (AAV-h¿-syn) in the substantia nigra compacta (SNpc). We observed a progressive h¿-syn overexpression in the SNpc and the adjacent ventral tegmental area (VTA) associated with dopaminergic neuron degeneration in both nuclei. Moreover, h¿-syn was also expressed in the glutamatergic neurons of the VTA, which together with the dopaminergic neurons, project to the hippocampus modulating hippocampal function and memory processes. In the hippocampus, we observed a progressive h¿-syn expression within the different afferent pathways from the VTA (dopaminergic, glutamatergic and GABAergic pathways) since the earliest stages after theAAV-h¿-syn inoculation. Furthermore, AAV-h¿-syn inoculated animals showed a trend towards decreased performance in a hippocampal-dependent memory task, which was concomitant to the onset of nigral dopaminergic degeneration and motor impairment. Interestingly, long-term potentiation (LTP), the cellular mechanism for memory storage, was already impaired in the hippocampal synapse since the beginning of h¿-syn expression, probably through increasing basal synaptic transmission. The dopaminergic agonist pramipexole (PPX) and the dopamine precursor L-DOPA restored hippocampal LTP in the AAV-h¿-syn animals, although the latter was only effective at the latest time point evaluated. This might be explained by the compromised intracellular transport and synaptic vesicle trafficking observed by using a proteomics approach and suggesting a deficient neurotransmitter release at the earliest time points after the AAV-h¿-syn inoculation. By contrast, at the latest time point after the AAV-h¿-syn inoculation, deregulated proteins in isolated hippocampal synapses are involved in homeostatic processes such as the regulation of calcium levels, membrane potential, and receptor-mediated signaling pathways. Finally, with an in vivo PET study, we found decreased glucose metabolism in the hippocampus of animals with an established dopaminergic lesion chronically treated with PPX. Overall, we show that progressive synucleinopathy is associated with early synaptic dysfunction in the hippocampus and defective memory, providing an excellent model for the development of disease modifying new synapse-targeted therapies for Parkinson¿s disease.

de miles de proteínas en las células. Estas modificaciones provocan cambios significativos en el proteomacelular rápidamente, permitiendo a las células responder frente a diferentes estímulos in cambios en sumicroambiente. En esta tesis, hemos encontrado que la modificación postraduccional llamada neddylationes un regulador crítico de la mielinización en células de Schwann. El silenciamiento genético en célulasde Schwann del gen Nae1 (llamado NAe1 cKO), la enzima que inicia la cascada de neddyaltion, causanotables defectos en los nervios periféricos mostrando síntomas similares a los observados en neuropatíasgraves. Estos defectos incluyen: la reducción de la velocidad de conducción nerviosa, la ausencia demielina en los nervios periféricos y la degradación de la mielina en células de Schwann . Al mismotiempo, pudimos detectar en los ratones silenciados grandes cambios en el perfil transcriptómico yproteómico de las células de Schwann. Estos resultados sugieren que la actividad de las Cullin RingLigases (CRL) podría estar afectada, lo que podría estar impidiendo la degradación de reguladoresnegativos de la mielinización como c-Jun y Sox2. Por otro lado, no fuimos capaces de relacionardirectamente la neddylation con el mantenimiento de las vainas de mielina en ratones adultos ni conpapel de las células de Schwann en la regeneración de nervios periféricos en respuesta a daño en losmismos.

Several important cognitive functions affected by traumatic brain injury (TBI) depend on the hippocampus, which harnesses several forms of neural plasticity, among them adult neurogenesis, the generation of new neurons throughout life. Adult hippocampal neurogenesis is a process involved in memory, learning and control of anxiety, cognitive functions which result impaired after TBI. We hypothesize that TBI induces fast and long-term changes in both neural stem cells (NSCs) and newborn neurons which could subsequently alter hippocampal and brain functioning. Using a model of controlled cortical impact (CCI) we have found that TBI has a dual effect on neurogenesis: In the short term (up to two months) it causes an increase in the number of newborn neurons but with aberrant migration, increased soma size and altered electrophysiological properties; in the long term, neurogenesis resultsimpaired by a reduction in the number of immature neurons. We also suggest that the alteration in the expression of Rho Family GTPase 2 (Rnd2) could be causing some of the morphological changes in the immature neurons as well as their aberrant migration and thus could be a target to prevent TBI-induced aberrant neurogenesis, a hypothesis that we are currently investigating at the cellular level. In addition, we have found that NSCs get activated in higher numbers early after TBI, a result that could explain the later reduction in neurogenesis.

Los priones son agentes infecciosos causantes de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), un conjunto de enfermedades neurodegenerativas mortales. La teoría más aceptada propone que la PrPSc (isoforma patogénica de la proteína priónica celular, PrPC) es el único agente causal. PrPC y PrPSc no difieren en la secuencia aminoacídica, sino en su estructura. En la naturaleza, los priones surgen en forma de diferentes cepas cuyas propiedades se atribuyen a variaciones de la conformación espacial. Aunque los mecanismos moleculares que subyacen a su formación y mantenimiento son aún poco conocidos. En esta tesis, se han generado un conjunto de semillas potencialmente distintas dado su origen y su patrón de movilidad electroforética, utilizando PrP recombinante de topillo rojo y dextrano sulfatado como cofactor. Estas semillas presentaron diferentes propiedades cuando se inocularon en el modelo de ratón transgénico TgVole. Para su caracterización bioquímica, se analizó su capacidad para malplegar PrP no homólogas. Las diferencias observadas permitieron una clasificación y diferenciación rápida de las semillas, así como analizar posibles cambios debidos a alteraciones en el entorno de propagación. Estas se abordaron mediante la eliminación del cofactor y la adición de urea. Las semillas resultantes fueroncaracterizadas, revelando diferencias con las semillas originales y entre ellas. En conjunto, se obtuvieron 17 semillas diferenciables bioquímicamente entre sí. Las características más importantes para la diferenciación entre las cepas son el patrón de movilidad electroforética y su capacidad para maplegar PrP de topillo rojo con las mutaciones 109M y 109L, así como las PrP de ratón y oveja. Por todo ello, el sistema desarrollado permite la clasificación de la diversidad de cepas según las propiedades mostradas in vitro, lo que podría correlacionarse con sus propiedades biológicas, permitiendo en un futuro la predicción de sus fenotipos esperados in vivo.

La distrofia muscular de cinturas R1 asociada a calpaína 3 (LGMDR1) o calpainopatía, es una distrofiamuscular con herencia autosómico recesiva causada por mutaciones del gen CAPN3. El presente trabajode investigación profundiza en el conocimiento de la regulación de las alteradas rutas de Wnt y mTOR enpacientes LGMDR1. La utilización de inhibidores alostéricos de GSK3ß, Tideglusib y VP0.7 hapermitido recuperar la activación de las mencionadas rutas.El estudio en el pez cebra ha revelado los genes diana específicos de FRZB en la ruta de Wnt, subrayandola relevancia de la conservación evolutiva de este mecanismo y la relación entre la ruta de Wnt y laregulación de la calpaína 3. En el modelo de ratón knock out de la calpaína 3, el cual no presenta unfenotipo distrófico, la inhibición farmacológica de la ruta de Wnt por medio de Pyrvinium, ha dado lugara características distróficas observadas en los pacientes LGMDR1.Analizando el metabolismo en la LGMDR1, se ha identificado la participación de proteínas implicadas enla sustitución del tejido muscular por tejido adiposo observado en los pacientes, así como la relevancia deFRZB en la regulación de la función metabólica celular.

This PhD Thesis discusses several topics related to microglia, the resident macrophages of the brain parenchyma. They are derived from yolk sack primitive macrophages that colonize the brain early during embryonic development. Microglia contribute to the correct development and functioning of the central nervous system with their multiple functions, including their role as phagocytes clearing the brain parenchyma from apoptotic cells and protein aggregates. Microglia are also involved in most neurological and neurodegenerative diseases, especially since genome-wide association studies have found that many microglia-specific genes are significant risk factors for neurodegenerative diseases. This PhD Thesis focusses on two aspects of microglial physiology. First, on the development of human models of microglia and their importance in the use of microglia as a therapeutic target in neurodegenerative diseases. Finally, on microglial process motility and phagocytosis, two essential functions of homeostatic microglia that can become compromised in pathology. This thesis defines a method for the semi-automated analysis of microglia in 3D and how inflammation affects microglial motility. This thesis also shows how an impairment of phagocytosis in the adult neurogenic niche negatively affects the neurogenic cascade suggesting a crosstalk between microglia and neural progenitor cells.

Las enfermedades priónicas, también conocidas como encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), son enfermedades neurodegenerativas que afectan a humanos y animales, y para las que no existe cura. En su patogénesis juega un papel fundamental la proteína del prion celular (PrPC) que al mal plegarse se transforma en una isoforma patógena (PrPSc) con capacidad autopropagativa y cuya acumulación está asociada a neurodegeneración. La PrPC es una proteína de superficie celular unida a glicosilfosfatidilinositol (GPI) que contiene un dominio globular articulado y una región N-terminal flexible. Se han descrito diversas enfermedades priónicas que afectan a diferentes áreas del cerebro dando lugar a manifestaciones clínicas claramente distinguibles causadas por PrPSc con conformaciones diferentes. A estos priones con secuencias de aminoácidos idénticas pero causantes de patologías diferentes se las conoce como cepas y sus propiedades parecen estar codificadas en sus estructuras tridimensionales. Además, recientemente se ha demostrado que distintos cofactores pueden desempeñar un papel clave en la selección conformacional de priones, lo cual es importante para comprender la patogénesis de las enfermedades priónicas y su capacidad de propagación en diferentes tejidos o huéspedes.El mecanismo neurotóxico de la isoforma patógena es aún desconocido. No obstante, numerosos estudios señalan la importancia del extremo amino terminal y, en concreto, la secuencia polibásica de la PrP (aminoácidos del 27-31) como moduladora de la toxicidad y como región crítica para la conversión de PrPC a PrPSc, así como en el mantenimiento de las características de cepa.Utilizando la técnica de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (del inglés PMCA) que mimetiza la propagación de priones in vitro con una eficiencia similar al proceso que ocurre in vivo pero con una cinética acelerada, se ha estudiado en detalle el papel de diferentes deleciones de la proteína priónica en el mal plegamiento, propagación y mantenimiento de las propiedades de cepa in vitro. Para ello, se generó una diversidad de PrPs recombinantes de ratón delecionadas tanto en la región C-terminal como en la N-terminal. En este trabajo se ha evaluado la capacidad de mal plegamiento de las proteínas delecionadas en la región N-terminal tanto inducida por una PrPSc preformada actuando como semilla iniciadora del proceso y también espontáneamente (sin semilla). En estos dos procesos de malplegamiento se ha observado la generación de diferentes variantes conformacionales (posibles cepas), independientemente del uso de semilla. Las nuevas proteínas mal plegadas se han caracterizado bioquímica y biológicamente, demostrando su capacidad infectica en ratones. Por otro lado, se ha demostrado que las proteínas mal plegadas generadas espontáneamente están sometidas a una doble selección cuando se propagan a expensas de diferentes sustratos: una efectuada por la región polibásica de la proteína y la otra llevada a cabo por un cofactor exógeno que favorecería la propagación de conformaciones infecciosas. Así, este trabajo confirma la relevancia de la región N-terminal y en concreto la secuencia polibásica de la PrP en tres eventos clave como son la capacidad de mal plegamiento, la determinación de características propias de cepa y la neurotoxicidad.

La esclerosis múltiple es una enfermedad del sistema nervioso central para la cual no existen fármacos que promuevan la remielinización. Por ello, la comunidad científica está realizando un gran esfuerzo por desarrollar terapias que fomenten la generación de nueva mielina. En este sentido, los microRNAs, y más concretamente el miR-219a-5p, han sido postulados como eficaces inductores de la remielinización. Sin embargo, su administración al sistema nervioso central plantea ciertas dificultades.En este trabajo, el papel que juega miR-219a-5p en la inducción de la remielinización ha sido reforzado mediante el uso de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos, modelos organotípicos de desmielinización y el modelo animal de la enfermedad. Además, se ha analizado y comparado la habilidad de liposomas, nanopartículas y exosomas para administrar el microRNAs concluyendo que los exosomas es el sistema de administración más efectivos.

The cannabinoid CB1 receptor-mediated functions in astrocytes are highly dependent on the CB1 receptordistribution in these glial cells relative to neuronal sites, particularly at the nearby synapses under normalor pathological conditions. However, the whole picture of the subcellular CB1 receptor distribution inastroglial compartments remains uncompleted due to the scattered CB1 receptor expression, and thereforedifficult to detect, in astrocytes. Our laboratory has in previous studies estimated that about 5-6 % of thetotal CB1 receptors in the hippocampal CA1 stratum radiatum are localized in astrocytes identified by themarker glial fibrillary acidic protein (GFAP). However, GFAP is a cytoskeleton protein mostly restrictedto the astroglial cell bodies and their main branches. This might be distorting the actual proportion andtotal amount of CB1 receptors in astrocytes. Therefore, the search for alternative astroglial markers todecipher the precise mapping of CB1 receptors in astrocytes is a timely goal in the cannabinoid field. Theglutamate aspartate transporter (GLAST) is used as astroglial marker and raises as a good astroglialmarker candidate to study in detail the CB1 receptor distribution in astrocytes.To prove this hypothesis, I have used a pre-embedding immunogold method for electron microscopy tocompare first the astroglial distribution of GLAST versus GFAP. GLAST labeling was along the plasmamembrane of astrocytes, including cell bodies and the smallest astrocytic projections in close contact withneurons, capillaries and other glial cells, covering altogether a much broader labeled area than GFAP.Furthermore, the use of a pre-embedding immunoperoxidase method for electron microscopy served meto assess that almost three times more astroglial area is visualized with GLAST than GFAP, and thatGLAST detects four times as much astroglial membranes as GFAP. Finally, a double pre-embeddingimmunogold/immunoperoxidase method allowed to estimate that about 12 % of the total CB1 receptorparticles are localized in GLAST-positive astrocytes, but the value drops to 5-6 % in GFAP-positiveastrocytes, as published previously by our laboratory.Once these findings were obtained, I studied in more detail the CB1 receptor localization in astroglialmitochondria. We discovered the presence of functional CB1 receptors in mitochondrial membranes ofhippocampal neurons and astrocytes. Accordingly, I used double GLAST-CB1 immunolabeling toanalyze in the electron microscope the density of mitochondrial CB1 receptors in neurons and astrocytesin four brain regions: CA1 hippocampus, prefrontal cortex, piriform cortex and nucleus accumbens. Theresults showed that the CB1 receptor density in astrocytic mitochondria is higher than in neuronalmitochondria. Altogether, despite the lower absolute levels of CB1 receptors in astrocytes than inneurons, the density of mitochondrial CB1 receptors in astrocytes is higher than in neurons in the fourbrain regions studied. Namely, CB1 receptors are more expressed in astroglial than neuronalmitochondria. Activation of mitochondrial CB1 receptors alters energy production in neurons and cancause memory impairment. Likewise, activation of mitochondrial CB1 receptors in astrocytes interfereswith glucose metabolism and lactate production, disrupting neuronal functions and social behavior.In conclusion, the findings that astrocytes of the four brain regions studied contain more CB1 receptors intheir mitochondria than the neuronal mitochondria, and that the cannabinoid-induced reduction of oxygenconsumption is absent in mitochondria isolated from the forebrain of GFAP-CB1-KO mice, suggest thatmitochondrial CB1 receptors in astrocytes play a crucial role in the global effects of cannabinoids onbrain mitochondrial respiration.

Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET) son un conjunto de desórdenes neurodegenerativos mortales que afectan a varios mamíferos incluidos los humanos, cuyo agente causante es una isoforma anormalmente plegada (PrPSc) de la proteína del prion celular (PrPC) que adquiere propiedades neurotóxicas y la capacidad de inducir su conformación a otras proteínas del prion. Ninguna de las estrategias terapéuticas desarrolladas durante las últimas décadas ha sido efectiva frente a las EET humanas. La escasez de modelos in vitro e in vivo adecuados para el estudio de las EET humanas hacen que el cribado masivo de compuestos inhibidores de la propagación priónica sea una de las estrategias más exploradas en la actualidad. La mayoría de las moléculas con potencial terapéutico estudiadas en modelos no específicos frente a las EET humanas han revelado un problema de especificidad de especie e incluso de cepa priónica. En esta tesis doctoral, basándonos en la metodología de propagación de priones in vitro PMSA, y tras la modificación de los parámetros fundamentales, se han obtenido distintas PrP recombinantes humanas malplegadas espontáneamente con características depriones bona fide, cuya adaptación a un sistema de cribado masivo ha permitido evaluar la capacidad anti-priónica de un grupo de 18 tetrapirroles. A su vez se ha explorado la capacidad de adsorción de las PrP recombinantes humanas malplegadas a partículas esféricas, lo que ha permitido desarrollar una novedosa metodología de propagación sencilla, rápida y reproducible apta para el cribado masivo de compuestos. Así, los nuevos sistemas de cribado masivo de compuestos anti-priónicos han quedado validados para la búsqueda de compuestos terapéuticos específicos frente a las EET humanas.

El consumo excesivo de alcohol, especialmente durante la adolescencia, es una preocupación generalizada de salud pública. Investigaciones en la última década han puesto de manifiesto que el consumo de etanol (EtOH) y el sistema endocannabinoide (eCB) interactúan recíprocamente para modificar la actividad y el comportamiento neuronal. Sin embargo, el impacto duradero de la ingesta de EtOH durante la adolescencia, en la localización y función del receptor Cannabinoide Tipo I (CB1) en el cerebro adulto y, en última instancia, en el comportamiento neurológico, sigue siendo desconocido. En este estudio de doctorado, se usaron ratones C57BL / 6J machos adultos para investigar la localización y la función del receptor CB1 en las sinapsis del trayecto perforante medial excitador (MPP) en la capa molecular dentada del hipocampo. Nos enfocamos en estas sinapsis porque: primero, integran el circuito tri-sináptico excitatorio del hipocampo involucrado en el aprendizaje y la memoria; segundo, las sinapsis MPP muestran una alta eficiencia en la activación neuronal; y tercero, pero no menos importante, la ingesta persistente de EtOH durante la adolescencia daña la corteza entorrinal y la circunvolución dentada y afecta la transmisión sináptica y la plasticidad. En particular, se estudió la implicación de losreceptores CB1 y el sistema eCB en la depresión a largo plazo de las sinapsis de células excitadoras de la MPP (CB1-eLTD), un tipo concreto de plasticidad sináptica. Luego, las consecuencias de la ingesta de EtOH adolescente en la transmisión y plasticidad sináptica de MPP se examinaron en la edad adulta después de la exposición de ratones C57BL / 6J machos adolescentes (día postnatal 32) a un consumo excesivo de alcohol de 4 días durante un período de 4 semanas (desde el día postnatal 32 hasta el 56) seguido de dos semanas de abstinencia de EtOH. Para alcanzar los objetivos propuestos, llevamos a cabo un enfoque experimental multidisciplinario basado en electrofisiología, inmunohistoquímica, comportamiento y técnicas de biología molecular. Los principales resultados de la Tesis Doctoral son: En primer lugar, la estimulación de baja frecuencia (10 min, 10 Hz) de la MPP desencadena CB1-eLTD en las sinapsis MPP. Este fenómeno de plasticidad es dependiente de los receptores de glutamato, en concreto de los receptores metabotrópicos del grupo I (mGluR), además requiere afluencia de calcio intracelular y síntesis de 2-araquidonoil-glicerol (2-AG). En segundo lugar, CB1-eLTD en las sinapsis MPP está ausente en ratones adultos después del consumo adolescente de EtOH. Además, la activación del receptor CB1 inhibe los potenciales postsinápticos excitatorios de campo (fEPSPs) evocados después de la estimulación de MPP en simulaciones adultas, pero no en ratones expuestos al EtOH. En tercer lugar, la ingesta de EtOH en adolescentes reduce significativamente la expresión del receptor CB1 en terminales sinápticos excitadores localizados en la zona de terminación MPP dentada, disminuye la unión basal [35S] guanosina-5 * -O- (3-tiotrifosfato) ([35S] GTP¿S) y la expresión de la subunidad G¿i2 y aumenta significativamente el ARNm y la proteína monoacilglicerol lipasa (MAGL) en el hipocampo adulto. En cuarto lugar, los ratones expuestos a EtOH muestran una memoria de reconocimiento, memoria espacial y memoria asociativa significativamente inferiores, así como una reducción significativa en la coordinación motora y el equilibrio después de dos semanas de la última sesión de EtOH. Sin embargo, no se detectan comportamientos de ansiedad o depresivos permanentes significativos. En quinto lugar, el aumento de 2-AG endógeno por el inhibidor de MAGL JZL184 rescata la CB1-eLTD y revierte la pérdida significativa de memoria de reconocimiento observada en ratones tratados con EtOH. En conclusión, el consumo excesivo de alcohol en adolescentes conduce a déficits en la transmisión excitatoria dependiente del receptor CB1 y la plasticidad en las sinapsis de células granulares de la vía perforante medial que se correlacionan con la pérdida de memoria y la alteración motora en ratones adultos. Además, tanto la CB1-eLTD como la memoria pueden recuperarse en ratones EtOH al aumentar los niveles endógenos de 2-AG.

Our society lives embedded in stress. This causes numerous environmental factors that precipitate and exacerbate psychiatric disorders, such as anxiety and depression. In all organisms, stress is recognized as an adaptive response and is essential for survival to re-establish homeostasis. The brain is the most sensitive organ to stress and responsible for generating an adaptation to stressors, both social and physical. In mammals, multiple brain areas, such as the hippocampus, amygdala, prefrontal cortex and hypothalamus are activated in response to the threat of homeostasis disruption. In particular, the hippocampus is critically involved in many forms of learning and memory, as well as emotional processing and stress. Despite adolescence being a vital stage where numerous changes occur, research on changes in stress-related synaptic plasticity and the brain has been focused more on childhood and adulthood. The endocannabinoid (eCB) system is widely distributed in the central nervous system and participates in many brain functions. To better understand the role of the eCB system in the context of anxiety and how to cope stress is necessary an integrated view of the endocannabinoid-mediated control in brain regions involved in stress processing and regulation. In this Doctoral Thesis, adolescent Swiss male mice were used to investigate the localization and function of the CB1 receptor at the excitatory medial perforant path (MPP) synapses in the dentate molecular layer of the hippocampus in control, acute and chronic restraint stress condition. The rational behind is that these synapses show high efficiency in neuronal activation and contribute to the excitatory tri-synaptic circuit related to learning and memory in the hippocampus. Furthermore, restraint stress damages the entorhinal cortex and dentate gyrus affecting the entorhino-dentate (perforant) pathway. We studied in the Thesis the effect of acute and chronic restraint stress to adolescent mice on synaptic transmission and in particular on CB1 receptor dependent long-term depression at the excitatory MPP-granule cell synapses.

En la regulación de la neurogénesis hipocampal adulta, un paso fundamental es la división de las células madre neurales (NSCs) ya que, tras activarse, se dividen varias veces consecutivas y se diferencian después en astrocitos. En esta tesis demostramos que aumentar su tasa de activación mediante hiperexcitación neuronal conduce a su agotamiento e induce un cambio en su diferenciación. Tras provocar epilepsia directamente en el hipocampo de ratones, hemos observado que las NSCs aumentan su tasa de activación pero dejan de generar neuronas y se transforman en NSCs reactivas (React-NSCs) que se diferencian en astrocitos reactivos (RAs). Hemos validado mediante el empleo de una cepa transgénica que el receptor 1 del ácido lisofosfatídico (LPA1) sirve como marcador para rastrear las React-NSCs durante su conversión en RAs. Además, hemos probado que la deleción del gen LPA1 disminuye la activación masiva de las NSCs producida por las convulsiones epilépticas. Al someter a ratones a un modelo alternativo de epilepsia, actuando en la amígdala, comprobamos que las NSCs también se dividen más y se transforman en React-NSCs, demostrando que las NSCs se ven afectadas independientemente del sitio de origen de las convulsiones. Estos resultados muestran cómo en condiciones de hiperexcitación neuronal severa las NSCs contribuyen a la gliosis reactiva, lo que puede empeorar el pronóstico de la epilepsia, y que el receptor LPA1 participa en esta nueva función de las NSCs.

Existe gran evidencia de que el estrés oxidativo juega un papel fundamental en el desarrollo del trastorno mental grave. El objetivo de esta tesis doctoral es estudiar los niveles de capacidad antioxidante tras el debut de un trastorno mental grave y evaluar su relación con el estado clínico y funcional del paciente. Así mismo, se estudió también la influencia que la adherencia al tratamiento farmacológico tiene en dicha asociación.Durante el desarrollo de esta tesis se obtuvieron tres artículos científicos a partir de los cuales se estructuró el manuscrito. En el primero se realiza un estudio longitudinal en una muestra de 70 pacientes con un primer episodio psicótico, evaluando el estado antioxidante y su relación con la sintomatología clínica y funcional a lo largo de 2 años de seguimiento. El segundo artículo es un estudio longitudinal realizado en una muestra de pacientes con un primer episodio de manía, donde se estudia la relación de parámetros antioxidantes y de estrés oxidativo con el estado clínico y funcional de los pacientes, así como con la adherencia al tratamiento farmacológico a los 6 meses tras el debut de la enfermedad. El tercer artículo se trata de una revisión sistemática, donde se recogen los factores asociados a una malaadherencia al tratamiento farmacológico en pacientes con diagnóstico de esquizofrenia y trastorno bipolar.Los resultados obtenidos en los diferentes trabajos nos han permitido observar cómo en las etapas tempranas de la enfermedad, tras un primer episodio psicótico y de manía, la capacidad antioxidante se relaciona con el estado clínico y funcional de los pacientes, incrementándose los niveles de este parámetro cuanto mayor es la sintomatología del individuo. La adherencia al tratamiento farmacológico no presenta una influencia directa sobre los niveles de antioxidantes, si no, indirecta a través de la disminución de los síntomas, modulando el sistema de defensa antioxidante y provocando una menor activación del mismo. Intervenciones tempranas orientadas a la identificación de los factores asociados a la adherencia parecen, por lo tanto, esenciales, para el buen pronóstico de pacientes con diagnóstico de trastorno bipolar y esquizofrenia.

El objetivo de este trabajo consiste en la caracterización de ANKRD55, un gen de función desconocida asociado a la esclerosis múltiple (EM). Para ello, por un lado, se realizó un análisis basado en DNA y expresión génica que consistió en la identificación de la principal fuente celular de ANKRD55 en PBMC, donde los resultados mostraron que los tres transcritos de ANKRD55 se expresaron de forma única y elevada en los linfocitos T CD4+. Además, el genotipo de riesgo para la variante intrónica asociada a EM mostró niveles significativamente más altos de dos transcritos de ANKRD55 en células T CD4+. A continuación, utilizando el sistema CRISPR/deadCas9 se analizaron 5 variantes de DNA presentes en ANKRD55 por su posible actividad enhancer, donde se observó que la región que contiene la variante rs71624119 regula la expresión de uno de los tres transcritos de ANKRD55. Por otro lado, mediante el análisis basado en proteína, se estudió la localización subcelular y la red de interacciones proteína-proteína de ANKRD55. Se observó que la localización intracelular de la forma endógena de ANKRD55 era principalmente nuclear en células inmunes y no inmunes, mientras que las formas recombinantes se encontraban tanto en el núcleo como en orgánulos membranosos y citosol de las líneas celulares HEK293 y HeLa. A través de la inmunoprecipitación (IP) de una de las formas recombinantes de ANKRD55 y análisis mediante espectrometría de masas, se identificaron 158 proteínas en el extracto proteico total y 22 en extracto nuclear que interaccionan con ANKRD55, de las cuales ocho se validaron por microscopía confocal e IP y posterior immunoblot.

El objetivo de la presente tesis es el desarrollo de un modelo animal de parkinsonismo e impulsividad inducido por la administración del agonista dopaminérgico pramipexol (PPX).La enfermedad de Párkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por el desarrollo de alteraciones motoras (temblor, rigidez y bradicinesia) que están asociadas a una progresiva muerte de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra compacta pars compacta (SNc), la consecuente depleción dopaminérgica en el estriado y la aparición de agregados proteicos intracelulares (principalmente de ¿-sinucleína, (¿-syn)). La fisiopatología de la muerte neuronal es aún desconocida en gran medida, y los tratamientos disponibles actualmente están enfocados a mitigar los signos motores de la enfermedad mediante la reposición exógena del déficit dopaminérgico, principalmente mediante la administración de levodopa (precursor de la dopamina) y/o agonistas dopaminérgicos como el PPX. Sin embargo, estos tratamientos promueven un progresivo desarrollo de efectos secundarios motores y no motores a medio-largo plazo, de los que las disquinesias (movimientos involuntarios de tipo coréico) y las complicaciones psiquiátricas como el trastorno de control de impulsos (TCI) (que incluye el juego patológico, las compras compulsivas, la hipersexualidad y la ingesta compulsiva de comida) y otros trastornos impulsivos-compulsivos (síndrome de disregulación dopaminérgica (SDD)), son los más frecuentes e incapacitantes. A pesar de su negativa influencia sobre la vida diaria de los pacientes, la fisiopatología subyacente al TCI en la EP no está bien definida, a lo que contribuye la falta de modelos animales que reflejen lo más fielmente posible las características de este trastorno y se pueden llevar a cabo estudios en ellos.En este sentido, se han realizado diferentes aproximaciones en la literatura, pero se hacen imprescindibles nuevos estudios por diferentes motivos: el análisis de un único rasgo de la impulsividad en los tests conductuales usados o el uso de refuerzos artificiales (como la estimulación eléctrica de la amígdala) en vez de refuerzos naturales como la comida o el sexo, alejándose así del contexto clínico. Por ello, el uso de tests que puedan medir simultáneamente diferentes aspectos de los comportamientos impulsivos-compulsivos y que empleen refuerzos naturales se hace particularmente necesario.Por otro lado, la determinación de alteraciones moleculares en el estriado asociadas al TCI podría contribuir a conocer mejor la fisiopatología de este trastorno. A nivel molecular, la expresión del factor de transcripción FosB y su forma truncada ¿FosB se encuentra elevada en el CPu de ratas tratadas con sustancias psicoestimulantes y en ratas que presentan adicción por comida, lo que sugiere un papel relevante en adicciones a sustancias y adicciones conductuales. Estudios previos indican que ratas con parkinsonismo tratadas crónicamente bajo paradigmas de autoadministración de PPX muestran un aumento estriatal de FosB/¿FosB, pero no está claro si estos cambios se relacionan con un aumento de la impulsividad o si el aumento de la expresión se debe exclusivamente al fármaco, por lo que es necesario profundizar su estudio en modelos animales de impulsividad de la EP.Así, en este trabajo se han analizado diferentes tipos de impulsividad inducida por diferentes regímenes de administración de PPX en dos modelos animales de parkinsonismo en rata mediante los paradigmas comportamentales 5-Choice Serial Reaction Time-Task (5-CSRTT) y Variable Delay-to-Signal (VDS) en tres experimentos diferentes: 1) ratas con parkinsonismo mediante lesión dopaminérgica bilateral inducida por la sobreexpresión en SNc de A53T-h¿-syn mediada por vectores virales adenoasociados (AAV) a las que se les administró crónicamente PPX (0,25 mg/kg/día, 4 semanas) usando el test 5-CSRTT para el estudio conductual; 2) ratas con parkinsonismo por lesión dopaminérgica bilateral inducida por inyecciones bilaterales en la región dorsolateral (DL) del CPu (región motora) del neurotóxico 6-hidroxidopamina (6-OHDA) que fueron tratadas con dosis agudas (0,25 y 3 mg/kg) de PPX y evaluadas mediante el test VDS; 3) Ratas con parkinsonismo mediante lesión dopaminérgica bilateral inducida por la sobreexpresión en SNc de A53T-h¿-syn mediada por AAV a las que se les administró crónicamente PPX (0,25 mg/kg/día, 4 semanas) y estudio conductual mediante el test VDS.Brevemente, los tres modelos desarrollados en la presente tesis doctoral han mostrado un aumento de la impulsividad en ratas con parkinsonismo respecto a las ratas control tras el tratamiento con el agonista dopaminérgico PPX, ya sea administrado de forma aguda o crónica, y sugirieren que la lesión dopaminérgica en sí misma (particularmente una denervación más extensa y no restringida exclusivamente al área más motora del estriado) sería un factor determinantes para el desarrollo de la impulsividad bajo tratamiento dopaminérgico. Así mismo, los rasgos comportamentales propios de los animales antes de recibir el tratamiento podrían servir para detectar sujetos de riesgo para padecer impulsividad patológica bajo administración de PPX. Además, los resultados obtenidos en los diferentes modelos sugieren que la impulsividad generada por la administración de PPX es dependiente tanto de la dosis como del tiempo de tratamiento. De forma interesante, aunque el PPX produce un aumento de distintos subtipos de impulsividad en animales con parkinsonismo, el que conlleva un retraso en la obtención de la recompensa (impulsividad de espera e intolerancia al retraso de la recompensa) sería el que aumenta en mayor grado en ambos modelos animales de parkinsonismo, por encima del incremento de la impulsividad motora pura. Todos estos resultados son concordantes con lo que se ha sugerido u observado en clínica en pacientes de EP con TCI.Respecto al biomarcador molecular, la expresión estriatal del factor de transcripción FosB/¿FosB muestra resultados inconclusos y no correlaciona con el comportamiento en ningún caso. Por tanto, sugerimos que la expresión a nivel del estriado del factor de transcripción FosB/¿FosB no es un buen marcador de la impulsividad en estos modelos animales.Así pues, los diferentes modelos animales caracterizados en el presente trabajo muestran rasgos similares a los descritos en pacientes de EP y con TCI, lo que puede ser de una gran utilidad en el futuro para el estudio de la fisiopatología subyacente de este trastorno, así como para el desarrollo de nuevos abordajes terapéuticos que sirvan para mitigarlo.

Durante la neurgónesis del hipocampo adulto, la mayoría de las células recién nacidas mueren por apoptosis y son rápidamente eliminadas por la microglía residente del cerebro mediante el proceso denominado fagocitosis. En esta Tesis proponemos que la fagocitosis no es simplemente un proceso pasivo de eliminación de las células muertas, sino que tiene un papel activo en el mantenimiento de la homeostasis de la cascada neurogénica del hipocampo adulto produciendo reguladores neurogénicos. El análisis ontológico comparando microglía fagocítica y control en cultivo reveló que, además de cambios importantes en diferentes vías metabólicas y de señalización, la fagocitosis desencadenó un programa neuromodulador en la microglía. Además, los medios condicionados de microglía fagocítica alteraron la proliferación y la diferenciación de progenitores neuronales cultivados. Además, la administración in vivo del medio condicionado de microglía fagocítica mostró una regulación en la supervivencia de las células del linaje neural. En su conjunto, nuestos datos respaldan que tras la fagocitosis de células apoptóticas recién nacidas, la microglía inicia un programa de transcripción dedicado a apoyar el mantenimiento a largo plazo de la cascada neurogénica hipocampal adulta.

Las células de microglía constituyen los fagocitos residentes del cerebro. Una de las principales funciones de las células de microglía consiste en la fagocitosis de células apoptóticas. La fagocitosis depende de diversos receptores anclados a la membrana de la microglía y que permiten el encapsulamiento y posterior degradación de los cuerpos apoptóticos en su interior. En esta tesis pretendemos profundizar en el estudio de uno de estos receptores, llamado GPR34, que presenta un único ligando conocido, lysoPS. Los resultados muestran que GPR34 regula la fagocitosis microglial in vivo e in vitro, mientras que lysoPS parece ejercer un papel relevante solo en condiciones in vitro. Por otra parte, también se ha estudiado el posible impacto de la fagocitosis microglial tanto en el metabolismo microglial así como su posible influencia en la neurogénesis en el hipocampo. Los resultados mostraron que la microglía fagocítica sufría adaptaciones metabólicas en las vías mitocondriales así como en la morfología de las mitocondrias. Sin embargo, no se observaron efectos de la inhibición de la fagocitosis microglial sobre la neurogénesis hipocampal. En conjunto, nuestros datos reflejan la importancia de la fagocitosis microglial en diversos procesos celulares y el papel relevante de GPR34.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por la presencia de placas seniles compuestas por agregados del péptido beta amiloide (Aß), siendo las formas solubles las que mejor correlacionan con la progresión de la enfermedad. Aunque ha sido considerada una patología principalmente asociada a la muerte de las neuronas, se ha descrito un deterioro de sustancia blanca incluso previo al daño neuronal. Por tanto, proponemos que el Aß modula directamente la proliferación y la diferenciación de los oligodendrocitos (OLGs), alterando el estado de la mielina y contribuyendo así al deterioro de la sustancia blanca. En esta tesis, hemos observado que Aß modula la diferenciación de los OLGs, promoviendo la síntesis de la proteína básica de la mielina (MBP) a través de la inducción de la traducción local. Esta modulación está mediada por el receptor integrina ß1, Fyn y CaMKII. Además, el análisis detallado sobre el estado de los OLGs y la mielina en el modelo animal de EA triple transgénico reveló un aumento en la síntesis de MBP así como una desregulación en el patrón de diferenciación de los OLGs. Además, tras realizar estudio de la ultraestructura de la mielina observamos que el animal transgénico mostraba un daño en la integridad de la misma que conllevo fallos en la neurotransmisión. Finalmente, paciente con Alzheimer en fases avanzadas también mostraron un aumento de MBP en la corteza prefrontal y en el hipocampo. Asimismo, elevados niveles tanto de MBP como de CNPase se detectaron en pacientes con problemas cognitivos leves. Estos resultados describen el papel del Aß sobre la función oligodendroglial como parte clave en la progresión de la enfermedad.

La epilepsia es una de las enfermedades neurológicas crónicas más frecuentes, con un importante impactoen la calidad de vida del paciente. Por tanto, es primordial disponer de tratamientos para el control de lascrisis en aquellos pacientes que padecen una epilepsia farmacorresistente (EFR), especialmente si no soncandidatos a una cirugía curativa. Entre estas alternativas ha adquirido gran desarrollo la estimulación delnervio vago (ENV).El dispositivo de ENV genera impulsos eléctricos intermitentes que se propagan a través del nervio vagoen sentido aferente, reduciendo la actividad epileptiforme. La eficacia de esta terapia ha sido demostradaen diferentes series, Los efectos adversos de este tratamiento son leves, y habitualmente locales. Sinembargo, una de las preocupaciones ha sido la publicación de casos de bradicardia e incluso asistolia.El estudio que hemos realizado en el Hospital Universitario de Cruces confirma que la terapia deneuroestimulación mediante ENV es eficaz y segura en para pacientes con EFR. Además, la seguridad deeste tratamiento en la esfera cardiovascular queda confirmada, ya que no se observó ningún caso dearritmia cardiaca, ni taquicardia ni bradicardia. El estudio de disautonomía realizado confirma que elENV no modifica significativamente la actividad del sistema nervioso autónomo, e incluso podría tenerun efecto cardioprotector.

La distrofia de cinturas de tipo 2A (LGMD2A) es una enfermedad genética de herencia autosómicarecesiva, causada por mutaciones en el gen CAPN3, que codifica la proteasa muscular no lisosomalcalpaína 3. Los pacientes sufren una degeneración muscular progresiva que se inicia en la adolescencia yque afecta predominantemente a la musculatura de las cinturas escapular y pélvica y a los músculosproximales. A pesar de que se conoce el origen genético de la enfermedad, se desconoce la función que lacalpaína 3 ejerce en el músculo esquelético, y por qué su deficiencia da lugar a la LGMD2A. Estudiosrecientes sugieren que la calpaína 3 podría participar en el control del ciclo celular y en el mantenimientode las células satélite. Por ello, este estudio pretende investigar el papel que juega la calpaína 3 en lascélulas satélite y en la regeneración muscular. Para ello, hemos establecido dos estrategias; en la primera,se ha establecido un modelo celular miogénico a partir de iPSCs de pacientes con LGMD2A, en el que seha estudiado la expresión de la calpaína 3 y su maduración transcripcional a lo largo de la diferenciaciónmiogénica. En la segunda, se ha determinado la expresión de Capn3 en células satélite murinas, tanto enquiescencia como tras su activación, y se ha estudiado el efecto de la ausencia de calpaína 3 en las célulassatélite a nivel funcional. De estos estudios se concluye que los modelos miogénicos derivados de iPSCsde pacientes de LGMD2A y de controles sanos son una herramienta útil para el estudio de la función dela calpaína 3 en la miogénesis. Por otro lado, la detección de la expresión de Capn3 en células satélitemurinas tras su activación sienta las bases para seguir ahondando en el estudio de la función de lacalpaína 3 en las células satélite y en la regeneración muscular.

The human IL22RA2 gene co-produces three protein isoforms in dendritic cells (IL-22 binding protein isoform-1 [IL-22BPi1], -2 [IL-22BPi2], and -3 [IL-22BPi3]). Two of these, namely, IL-22BPi2 and IL-22BPi3, are capable of neutralizing the biological activity of IL-22. The function of IL-22BPi1, which differs from IL-22BPi2 through an in-frame, 32-amino-acid insertion provided by an alternatively spliced exon, remains unknown.This thesis focuses on the biochemical characterization of the three isoforms (in silico and in vitro), as well as the potential pharmacological targeting thereof. Additionally, it addresses the functionality of the non-synonymous single nucleotide polymorphism (SNP), rs28385692, which is located in IL22RA2 and has been found to be associated with multiple sclerosis (MS).El gen humano IL22RA2 coproduce tres isoformas en las células dendríticas (la isoforma-1 de la proteína de unión a la IL-22 [IL-22BPi1], la -2 [IL-22BPi2] y la -3 [IL-22BPi3]). Dos de ellas, la IL-22BPi2 y la IL-22BPi3, son capaces de neutralizar la actividad biológica de la IL-22. La función de la IL-22BPi1, que difiere de la IL-22BPi2 por una inserción de 32 aminoácidos mediante splicing alternativo, sigue siendo desconocida. El objetivo general de esta tesis es comprender la función y el destino de la IL-22BP mediante la caracterización bioquímica de sus isoformas. Los obteivos específicos son: estudiar la expresión de los transcritos de IL22RA2 y relacionarlos con la secreción de sus isoformas mediante su caracterización bioquímica, así como identificar los factores clave implicados en su plegamiento y secreción e investigar su secreción y función dentro de la célula; evaluar si las chaperonas identificadas pudieran ser utilizadas como posibles dianas terapéuticas que tuvieran efectos diferenciales en la secreción de las isoformas de IL-22BP; y determinar si la variante de riesgo de la EM, rs28385692, tiene efectos funcionales sobre las isoformas de la IL-22BP y en qué medida.

Aportación de la ecografía tridimensional al estudio del desarrollo evolutivo del cerebro fetal.Se analizan los aspectos básicos de la anatomía cerebral y los aspectos en relación a la obtención y procesado de datos en ecografía volumétrica (tridimensional).Se plantean objetivos relacionados con la capacidad de la ecografía 3D para obtener resultados comparables a la ecografía convencional en 2D en relación a la obtención de biometrías y visualización tanto de cortes como de estructuras cerebrales. Asimismo, se plantea si ciertos parámetros biométricos y antropométricos influyen en la calidad de la ecografía 3D y se pretende establecer un mapa cronológico básico del desarrollo del cerebro fetal.Para ello, se seleccionaron 167 casos de ecografías practicadas a mujeres gestantes entre las semanas 19 y 32 de embarazo en 3 bloques de edad gestacional y se obtuvieron datos que, tras análisis metodológico y estadístico, ofrecieron los resultados obtenidos. Dichos resultados muestran la aportación de la ecografía 3D al estudio prenatal del cerebro fetal y establecen un mapa básico del desarrollo del cerebro fetal en relación a la edad gestacional, ofreciendo una cronología de aparición en ecografía de surcos, cisuras y ungran número de estructuras cerebrales. La ecografía 3D permite una mejora en la visualización del cerebro fetal y puede proponerse como método de apoyo al estudio del desarrollo y la patología cerebral del feto.

Se estudia el efecto de polimorfismos genéticos funcionales de la catecol-o-metil transferasa (COMT), del trasportador de serotonina y de la monoamino oxidasa-A (MAO-A) sobre dimensiones de la personalidad, según el modelo de Livesley, en una muestra de 150 pacientes con trastornos de la personalidad de cluster B y 148 controles sanos. Además, se explora si los polimorfismos estudiados interaccionan con variables ambientales adversas, como la experiencia de trauma y los antecedentes de patología mental en progenitores. Observamos, en la muestra completa de individuos, que los genotipos de la COMT que producen una mayor actividad catabólica de dopamina se asocian a un fenotipo extrovertido-temerario, y en los casos de actividad catabólica más extrema, también a rasgos disociales. En relación a los polimorfismos del transportador de serotonina, hemos hallado que los genotipos de baja actividad se asocian a un perfil disocial en pacientes, no así en controles. Además, al analizar la interacción con las variables ambientales adversas, hemos hallado que la concomitancia de genotipo de baja actividad y trauma se relaciona con mayor Insensibilidad, así como con tendencia a presentar mayor puntuación en otras dimensiones de tipo disocial. Finalmente, no se ha evidenciado ninguna asociación entre el polimorfismo de la MAO-A estudiado y dimensiones de personalidad.

El estudio de la miogénesis y de diversas enfermedades neuromusculares requiere generalmente el uso de técnicas in vitro, idealmente de cultivos primarios tridimensionales.En esta tesis, se ha identificado la población de precursores miogénicos de la piel como la de las células satélite del panículo carnoso, se ha propuesto un sistema de aislamiento y cultivo tridimensional para expandir y obtener una diferenciación miogénica de dichas células in vitro, y se ha evaluado su potencial regenerativo in vivo.Asimismo, se ha trasladado este sistema de cultivo y diferenciación celular a biopsias de músculo cremáster humano analizando su potencial miogénico tanto in vitro como in vivo y mostrando así las primeras evidencias de su aplicabilidad en futuras terapias celulares.Por último, se ha estudiado el papel fisiológico del panículo carnoso y se propone su idoneidad para el estudio de diversos procesos biológicos relevantes como la cicatrización o la incorporación de células derivadas de la médula ósea donante tras un trasplante.

La hiperprolactinemia es un efecto secundario del tratamiento con risperidona o paliperidona que puede paliarse de forma eficaz añadiendo aripiprazol al tratamiento. Nuestro objetivo es valorar factores clínicos y demográficos pueden influir en el efecto del aripiprazol. Presentamos un ensayo clínico, realizado en 20 mujeres y 54 hombres con esquizofrenia, en monoterapia con risperidona y/o paliperidona. Se añadieron 5mg/día de aripiprazol, valorando la prolactina sérica y el estado psicopatológico al cabo de 1 y 4 semanas. Inicialmente, el 95% de las mujeres y 92% de los hombres presentaban hiperprolactinemia. Los niveles medios de prolactina (SD) eran mayores en mujeres 110.94ng/ml (54.01) que en hombres 48.11 (28.76), en los más jóvenes y en los que llevaban menos tiempo en tratamiento. El aripiprazol disminuye significativamente la prolactina sérica desde la primera semana y de forma diferente según el sexo. La primera semana disminuye 26.57 ng/ml (42.82) en mujeres y 9.52 (10.56) en hombres; en mujeres hay una diminución adicional de 23.37 ng/ml (49.41) hasta el día final, en hombres es de 1.73 (13.02). En cuanto a las variables intra-sujetos, los niveles son superiores en mujeres que en hombres y en los de menor edad. La dosis de antipsicótico, el tipo de tratamiento o su duración no influyen significativamente. La disminución porcentual de prolactina es mayor en mujeres (mediana=56.8%) que en hombres (23.7%). La hiperprolactinemia se normaliza en 8 individuos, sin embargo, la gravedad asociada disminuye de forma considerable. Aun así, un 61% de mujeres tienen niveles finales clasificados como moderados-graves frente a un 15% de hombres.Se detecta una disminución de la sintomatología positiva y negativa al cabo de un mes, independiente del sexo, aunque inicialmente los hombres estaban más graves que las mujeresAñadir 5mg/dia de aripiprazol es eficaz para disminuir los niveles de prolactina y la gravedad asociada a la hiperprolactinemia; siendo la respuesta diferente según el sexo.

La hipótesis del continuum de la psicosis defiende que tanto sujetos de la población general, como pacientes con un trastorno de personalidad (TLP) o un brote psicótico manifiesto, comparten características cognitivas, comportamentales y emocionales. Por otro lado, los patrones de apego son muy importantes para comprender el papel que desempeñan los factores ambientales en la vulnerabilidad y el desarrollo de la psicosis. En la actualidad existe un número importante de estudios que exploran las asociaciones entre los estilos de apego, la cognición y los síntomas psicóticos. A pesar de ello, se requieren aún más estudios para poder aclarar cómo se relacionan entre sí.Este trabajo está orientado a tratar de conseguir un mejor conocimiento acerca del apego adulto y los trastornos mentales graves, como los primeros episodios psicóticos (PEP) y los TLP. Para ello se ha planteado un doble objetivo. Por un lado, y como principal objetivo, examinar la posible asociación de una variable ambiental como el apego adulto con alteraciones de la cognición social (concretamente las speech illusion y jumping to conclusions (JTC)) y las experiencias psicóticas (positivas, negativas y depresivas), en la muestra total y en los tres grupos de la muestra (PEP, TLP y controles). Y por otro lado, un segundo objetivo sería comparar las diferencias existentes entre los dos grupos clínicos y los controles, en relación al apego adulto, las alteraciones en la cognición social y las experiencias psicóticas.Se han utilizado para este estudio 293 sujetos, de ellos 70 eran pacientes con un PEP, 38 con TLP y 185 controles. Como principales instrumentos de medida utilizamos el ECR-S para el apego adulto, el White Noise para las speech illusion, el Beads para JTC y el CAPE para las experiencias psicóticas.En relación a los resultados, nuestros hallazgos no apoyaron la asociación entre el apego adulto inseguro y la experimentación de speech illusion. Y se observó una mayor frecuencia de este fenómeno en los PEP, seguidos de los TLP y por último de los controles, en línea con anteriores investigaciones. Por otro lado, las personas con un apego seguro, presentaron una menor tendencia a experimentar JTC. En cambio, los que obtuvieron una mayor puntuación en la dimensión evitación y los PEP que mostraron un apego rechazante tenían una mayor probabilidad de JTC. Se dio una mayor frecuencia a la hora de experimentar este fenómeno en el grupo de PEP. Con respecto a las dimensiones de apego adulto, cuanto mayor era el nivel de apego ansioso mayor era la tendencia a experimentar experiencias psicóticas de todo tipo en los tres grupos. En cambio, a mayor puntuación en la dimensión evitación, mayor nivel de síntomas negativos y depresivos en el grupo control y TLP. En relación a los tipos de apego adulto, observamos que a mayor apego seguro, menor era la tendencia a experimentar sintomatología psicótica en la muestra total. En cambio, explorando los tres grupos por separado, los pacientes PEP con apego seguro tenían menos síntomas positivos, los TLP menos sintomatología depresiva y el grupo control menos experiencias psicóticas negativas y depresivas. Por otro lado, también observamos que los PEP con un apego preocupado tenían un mayor nivel de síntomas positivos. Un apego rechazante en la edad adulta, daba como resultado un menor nivel de experiencias psicóticas, en la muestra total y en los tres grupos por separado. Los PEP y TLP con un apego temeroso, presentaban una mayor tendencia a sufrir experiencias psicóticas, excepto los síntomas positivos que se daban en PEP y TLP. En cambio, en la muestra total, a mayor apego temeroso esta tendencia a experimentar sintomatología psicótica aumentaba significativamente. Y por último, los TLP obtuvieron medias más altas que los PEP en experiencias psicóticas negativas y depresivas, y ambos grupos mostraron mayores valores que los controles. En cuanto a los síntomas positivos, tanto los TLP como los PEP, presentaron mayor puntuación que el grupo control.

Las malformaciones arteriovenosas cerebrales (MAVC) son anomalías vasculares congénitasintracraneales localizadas en el parénquima cerebral; consisten en una red de estructurasvasculares anormales conocidas como «nidus» o «nido», que se ubican entre arterias nutriciasy venas de drenaje. Son lesiones vasculares, generalmente de alto flujo, y aparecen cuando lasangre no atraviesa un sistema capilar, con el consiguiente riesgo de hemorragia intracranealpor la fragilidad de estas.

La enfermedad de Parkinson es una enfermedad crónica neurodegenerativa sin tratamiento curativo en la actualidad. En ausencia de un tratamiento eficaz que frene, module o cure la enfermedad, el impacto en la calidad de vida del paciente debe de convertirse en una absoluta prioridad. El estudio de los síntomas no motores, entre ellos, los disautonómicos permite alcanzar este objetivo. La correcta identificación y corrección de estos trastornos permite mejorar la morbi-mortalidad y aún más importante, mejorar la calidad de vida ya que este grupo de síntomas es el que más impacto tiene en la misma. Se han estudiado 3 muestras con un total de 358 pacientes para concluir el plan de investigación.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory neurological disease whose underlying cause remains uncertain and can be influenced by different environmental and genetic factors. We have studied two MS-susceptibility genes, IL22RA2 and IL12A, to better understand their regulation and relationship to MS. We demonstrated that the IL22RA2 gene gives rise to three isoforms in monocyte-derived dendritic cells (moDCs).. We also found that CD14++/CD16+ intermediate monocytes produced higher levels of IL22RA2 mRNA than classical and non-classical monocytes. Using transfected human cell lines, we demonstrated that the protein product of IL22RA2 variant 1 (IL22RA2v1), the IL-22BP isoform 1 (IL-22BPi1), was poorly secreted and largely retained in the endoplasmic reticulum (ER). We performed interactome analysis to uncover the mechanism underlying the ER retention of IL-22BPi1 and identified ER chaperones GRP78, GRP94, GRP170 and calnexin as main interactors. Structure-function analysis revealed that, like IL-22BPi2, IL-22BPi1 binds to the substrate-binding domain of GRP78 as well as to the middle domain of GRP94, and thus, we have demonstrated the domain of interaction of IL-22BPi1 and IL-22BPi2 with GRP78 and GRP94. Upon silencing of IL22RA2 expression in moDC, GRP78 levels were significantly reduced, suggesting that native IL22RA2 expression naturally contributes to upregulated GRP78 levels in these cells. Finally, we demonstrated that another variant apart from the canonical IL12A was expressed in moDCs and in different immune and epithelial cells lines. Altogether, our work highlights the relevance of the study of splicing variants of MS susceptibility genes for a better understanding of the effect of the genetic factors in the disease.

La conducta suicida es un problema de salud global que causa alrededor de 800.000 muertes anuales en el mundo y está asociada a discapacidad y deterioro funcional. De acuerdo al modelo de estrés-diátesis y el enfoque biopsicosocial, el riesgo de suicidio puede aumentar por la interacción de factores de vulnerabilidad biológicos, psicológicos y sociales. Para un mayor conocimiento y mejorar la prevención, resulta de interés aumentar el conocimiento en relación a estas variables y en la búsqueda de biomarcadores de riesgo. Esta tesis tiene como objetivo estudiar la interrelación del rendimiento cognitivo, los parámetros de inflamación y otras variables psicológicas (trauma, eventos estresantes, agresividad, funcionalidad) en relación a las tentativas de suicidio. Para ello, se realizó una revisión de la literatura sobre el rendimiento neuropsicológico en suicidio y dos estudios originales con una muestra compuesta por pacientes deprimidos con intento de suicidio reciente, pacientes deprimidos con intento de suicidio pasado, pacientes deprimidos sin antecedentes de intentos de suicidio y controles sanos. Los resultados sugieren la existencia de alteraciones cognitivas específicas en suicidio, en concreto en la atención. Además, en los intentos recientes las funciones ejecutivas estaban específicamente alteradas y la inflamación aumentada. Además, dicho aumento de la inflamación se relacionó con el abuso físico en la infancia y vida adulta, con los antecedentes de conducta agresiva en la infancia, así como con un peor rendimiento cognitivo y peor funcionalidad en la actualidad.

El hipocampo del cerebro de la mayoría de los mamíferos, incluyendo humanos, es capaz de generar nuevas neuronas a partir de de células madre neurales (NSCs) lo largo de la vida adulta mediante un proceso llamado neurogénesis hipocampal adulta (AHN). La AHN está implicada en la memoria, el aprendizaje, la separación de patrones y la regulación de la ansiedad. La cantidad total de neurogénesis de un organismo depende de las propiedades de las NSCs. Por ello hipotetizamos que las alteraciones de las propiedades intrínsecas de las NSCs en condiciones fisiopatológicas, como la epilepsia o el envejecimiento, son la causa primera de la AHN disfuncional encontrada en estas condiciones. En efecto hemos comprobado en un modelo murino de epilepsia que las NSCs abandonan su programa neurogénico para generar astrocitos reactivos participando así en la respuesta inflamatoria del hipocampo. Esta transformación está dirigida por la hiperactividad neuronal y hemos identificado al ATP como un posible efector principal en la comunicación entre las neuronas y las NSCs. Las NSCs se van agotando a medida que se activan para generar neuronas, de manera que su población decrece con la edad. Además hemos descubierto que las NSCs que permanecen sin activarse para generar neuronas durante el envejecimiento adquieren un fenotipo (morfológico y funcional) senescente, lo que explica junto a su agotamiento la marcada reducción de la AHN asociada a la edad.

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica e inflamatoria del sistema nervioso central, que provoca desmielinización y degeneración axonal. Por su parte, la microglía es la célula inmune residente en el sistema nervioso central, y su activación se ha asociado al desarrollo de la mayoría de afecciones neurodegenerativas. Con esto en mente, en esta tesis doctoral se ha analizado el papel específico de la microglía en el desarrollo de la EM, en comparación con otras poblaciones mieloides, utilizando un compuesto que elimina selectivamente la población microglial, el PLX5622. A este respecto, se ha identificado un rol de la microglía modulando la presentación de antígenos necesaria para el ataque autoinmune a la mielina. En la segunda parte de la tesis, se ha analizado la implicación del factor de transcripción IRF5 en la activación microglial y su rol en la desmielinización y posterior remielinización. Se ha descrito una novedosa función de IRF5 modulando el procesamiento de lípidos de la mielina por parte de la microglía; de esta manera, la ausencia de este factor resulta en una falta de procesos regenerativos tras un proceso desmielinizante. Por último, se han analizado los mecanismos que modulan la reprogramación metabólica sufrida por la microglía activada, con el fin de encontrar targets para promover acciones beneficiosas en el contexto de la EM. Se ha identificado que la dinámica mitocondrial está asociada con los procesos de activación, pero no directamente modulando el cambio metabólico de lacélula. En conjunto, los resultados de esta Tesis amplían el conocimiento actual sobre el papel de la microglía en los trastornos desmielinizantes, así como sobre los mecanismos que subyacen a su activación en respuesta a la inflamación y la desmielinización.

Understanding the appearance of the neocortex in evolution requires the study of its stereotyped sensory processing circuits andtheir formation during embryonic development. These circuits appear in sensory structures of the telencephalon of different amniotespecies, which suggests their homology. However, their evolutionary history is still a matter of debate. If they were homologous,they would have evolved from a common ancestral circuit that was already present over 320 mya and inherit its developmentalpattern. Accordingly, only circuits generated in an equivalent fashion can be considered homologous. In this thesis, we have aimedto compare the development of high-order sensory processing circuits in different pallial regions of selected amniote species inorder to study their evolution. For that, we have used traditional birthdating in vivo methods at different neurogenic timepoints,focusing on the main sensory processing circuits: cortical in mammals and DVR and hyperpallium in birds. For their neuronalpopulations we have defined 1) the neurogenic period when these are generated and 2) their final brain position. An additionalsource of evidence on the developmental trajectories has derived from an exhaustive analysis of neuronal transcriptomes by scRNASeq,after the isolation of birthdated neurons with BirthSeq, a novel method we have developed to isolate viable cells according totheir birthdate. We have identified different developmental instructions for the constructions of these circuits. Crucial differencesare that 1) most hyperpallial neurons are preferentially born at mid-neurogenic stages, versus the wide temporal spread of thecortical neuronal birthdate; and 2) while the latest born neurons of the pallium do not participate in the DVR circuit, theirmammalian homologues actively contribute as cortical integrators. Additionally, we have described the existence of a highdivergence of the pallial glutamatergic neurons that comprise sensory circuits. Taken together, all our results suggest that high-ordersensory circuits evolved separately in vertebrates but in parallel, and reached equivalent functional features by evolutionaryconvergence.

Alzheimer gaixotasuna adinekoen artean eman ohi den gaixotasun endekapenezko ohikoena da, baita dementzia motarik sarriena ere, kognizio eta oroimen asaldurak sortzen dituena. Oraingoz ez da lortu gaixotasun horren patogenesia argitzea, neuroinflamazio, oxidazio estresa eta gliosi erreaktiboa bezalako aldaketa patologiko ugari deskribatu diren arren.Bestalde, Sistema Endokannabinoideak Alzheimer gaixotasunean duen ekintza neurobabeslea dela eta, mikrogliaren aktibazioa eta Aß-ren neurotoxikotasuna ekidinez, besteak beste, honen azterketa bereziki interesgarria da gaixotasun honetan. Beraz, hemen aurkezten den doktorego tesian, hartzaile kannabinoide nagusien (CB1R eta CB2R) glia-zeluletako adierazpenean ematen diren aldaketak ikertu dira mikroskopia elektronikoaren bidez, astrozito eta mikroglia zelulen prozesuetan, hain zuzen. Honetaz gain, zelula glial hauen prozesuetan gertatzen diren aldaketa morfologikoak ere behatu dira. Bestalde, azterketa hau subikuluko eremuan egin da, plaka senilen pilaketa eta lesio goiztiarra aurkezten duen garunaren eremua delako. 6.5-7.5 hilabetetako adina zuten CB2EGFP/f/f/5xFAD eta CB2EGFP/f/f sagu mutanteak erabili dira. Familiako Alzheimer gaixotasuneko sagu eredua (CB2EGFP/f/f/5xFAD) eta bere kontrola (CB2EGFP/f/f), hain zuzen, eta biek proteina fluoreszente berdea (GFP) adierazten zuten CB2Rren promotorearen adierazpenaren pean.Mikroglia-zeluletako bi hartzaile kannabinoideen adierazpenaren handipena behatu izan dut, eta zelula hauen erreaktibitatearen adierazle diren aldaketa morfologikoak ere. Astrozitoen kasuan, nahiz eta erreaktibitate zeinuak ere topatu ditudan prozesuen morfologian, ez dut aldaketarik behatu CB1R-en adierazpenean.Aldaketa hauen ezagutzeak Sistema Endokannabinoideak eta gliak gaixotasun honen fisiopatologian duten inplikazioa ulertzeko lagungarria izan daiteke, etorkizunean itu terapeutiko bezala kontuan izateko.

La microglía es el macrófago del cerebro, en constante vigilancia del parénquima cerebral paragarantizar el mantenimiento de la homeostasis tisular. La microglía es ampliamente conocida por supapel como mediadora de la inflamación y la eliminación de material extracelular a través de lafagocitosis. Nuestro laboratorio esta interesado en la eliminación de células apoptóticas, tanto enfisiología como en patología; un proceso esencial para evitar el vertido del contenido citotóxico queresulta de la muerte celular y limitar así la inflamación debida a la fuga de moléculas tóxicas. Además dela fagocitosis, otro proceso esencial orientado a la preservación de la homeostasis tisular a través delreciclaje de componentes propios es la autofagia. Nuestro interés principal reside en la macroautofagia(autofagia de ahora en adelante), a través de la cual, la célula, puede reciclar múltiples macromoléculas,como proteínas, además de orgánulos dañados o envejecidos, como mitocondrias. Ambos fagocitosis yautofagia son procesos altamente conservados orientados al reciclaje de componentes extracelulares opropios, respectivamente, para mantener la homeostasis tisular además de ser parte del sistemaendosomal, que converge en el lisosoma. En esta Tesis Doctoral hemos querido responder a unapregunta principal: ¿cuál es la relación funcional entre autofagia y fagocitosis? Para ello, hemosestudiado el papel de la fagocitosis y la autofagia microgliales en un modelo in vitro de isquemiacerebral, además, hemos propuesto una nueva aproximación para analizar la autofagia usando el clásicoensayo de western blot, y hemos analizado la fagocitosis microglial en un modelo de epilepsia genética.Resultados previos del laboratorio, usando un modelo in vivo de oclusión de la arteria cerebral media(tMCAo), observamos que la fagocitosis estaba bloqueada. Primero determinamos los mecanismossubyacentes a la ausencia de oxígeno y nutrientes (OND) en dos modelos in vitro de cultivo organotípcode hipocampo y microglía primaria. La fagocitosis microglial estaba bloqueada después de la privaciónpero era rápidamente recuperada después de la reperfusión. Usando microscopía de doble fotónobservamos que la motilidad de los procesos microgliales estaba reducida, evitando el reconocimientode los cuerpos apoptóticos. En microglía primaria la OND bloqueó la degradación, pero no enenglobamiento, de los cuerpos apoptóticos acompañado de basificación del compartimento lisosomal acausa de la OND, así como una reducción en su número y tamaño. Las alteraciones en lisosoma nosllevaron a analizar los posibles cambios en la cascada autofágica, sin embargo, no detectamos cambiosLC3-II, probablemente debido a la limitada sensibilidad de la técnica. Por otra parte, si observamos unincremento en el número de vesículas autofágicas y el área que ocupaban mediante microscopíaelectrónica de transmisión (TEM). Estos descubrimientos desentrañaron in bloqueo tanto en elenglobamiento como en la degradación de células apoptóticas, probablemente debido a lasalteraciones en el compartimento lisosomal y a la inducción de una respuesta autofágica. Así mismo,analizamos el papel de la autofagia basal en la microglía usando tres modelos in vivo de deficiencia deautofagia y determinamos que la autofagia era necesaria para mantener la función fagocítica de lamicroglía y su supervivencia. Confirmamos dichos resultados in vitro usando inhibidor selectivo de laenzima ULK1, MRT68921, que indujo una reducción en la supervivencia y fagocitosis microgliales.Por otra parte, datos previos del laboratorio empleando el modelo de isquemia tMCAo, demostraronque la administración de la inductora de autofagia rapamicina, recobró parcialmente la fagocitosismicroglial después de la isquemia. Nuestra próxima aproximación fue testar el efecto de la rapamicinaen la autofagia y en la fagocitosis microgliales; sin embargo, no tuvo efectos detectables sobre laautofagia en condiciones basales ni tras la OND, analizada por western blot. La rapamicina no recobró lafagocitosis en cultivos organotípicos de hipocampo ni en microglía primaria. Por lo tanto, a pesar de serun compuesto beneficioso para recuperar la fagocitosis in vivo, la rapamicina no revirtió el bloqueo dela fagocitosis observado in vitro y no indujo cambio sobre la autofagia, al menos tras su análisismediante western blot.Para profundizar en el análisis de western blot, propusimos una serie de ecuaciones sencillas paracalcular tanto la formación como la degradación, considerando la autofagia como un proceso con unaentrada, formación de nuevos autofagosomas, y una salida, degradación de autofagosomas. Ladistinción entre formación y degradación y la adición del término ratio neto de cambio (net turnoverratio, formación/degradación) nos permitió discriminar los efectos de drogas específicas, que podríanactuar de forma diferente sobre formación y degradación.Finalmente, estudiamos la fagocitosis microglial en un modelo genético de epilepsia, la epilepsiamioclónica progresiva tipo I (EPM1), una enfermedad genética de inicio temprano en la que el gen quecodifica para la cistatina B (cstb) está mutado y da lugar a una proteína no funcional, un exceso deproteólisis, muerte celular y daño tisular. La fagocitosis microglial estaba bloqueada en ratonessintomáticos y confirmamos su bloqueo en ratones pre-sintomáticos. En primer lugar, a ausencia deCSTB exclusivamente en microglía, analizada usando un modelo de silenciamiento con siRNA enmicroglia BV2, no afectó a su capacidad fagocítica. Sin embargo pudimos derminar que el bloqueo de lafagocitosis observado in vivo se debió a la estrecha proximidad entre neuronas activas (cFOS+) y loscuerpos apoptóticos. El bloqueo de la fagocitosis microglial no se debía a una activación global delcircuito ni a la ausencia de Cstb por sí misma, sino a un fenómeno local más complejo.

Brain stroke is the second cause of death worldwide. Among the cerebrovascular accidents, ischemic stroke is the most common. It is caused by an interruption of blood flow, and it is characterized by sudden neuronal death (necrosis in the core) and apoptotic neuronal loss in the penumbra. After the generation of the glial scar surrounding the penumbra, ischemia in animal model can activate the neurogenic machinery in the subventricular zone (SVZ). However, the rapid formation of the glial scar after brain ischemia represents a double edged sword for brain survival. On one side, the ischemic scar isolates the healthy tissues from deadly factors released in the ischemic core but on the other hand, it impedes the neuronal regeneration from the SVZ. Previous results in our laboratory demonstrated that high levels of extracellular adenosine, one of the factors released after brain ischemia, could activate theSVZ and generate new astrocytes. In this PhD project, we used a mice model of transient brain ischemia by middle cerebral artery occlusion (MCAO) to accomplish the following objectives:1) To characterize the SVZ activation and astrogliogenesis following brain ischemia;2) To investigate the role of newborn astrocytes generated from the SVZ.By combining immunofluorescence with genetic cellular tracing (in vivo electroporation of neural progenitor cells) we demonstrated that brain ischemia induced the generation of newborn astrocytes from the SVZ. Newborn astrocytes expressed the specific marker Thbs4 and were derived from the activated Type B cells at the dorsal SVZ. The neural stem cells and the Thbs4 astrocytes generated from the SVZ, deviated their physiological route to the olfactory bulb and reached the ischemic scar. Here, astrocytes generated after brain ischemia could degrade and synthetize the hyaluronic acid of the extracellular matrix suggesting a dual role in the modulation of the ischemic glial scar. We demonstrated for the first time that astrocytes derived from SVZ can produce, uptake and degrade the hyaluronic acid of the extracellular matrix. Our results can open a new pharmacological strategy to modulate the formation and the remodeling of the glial scar, facilitate the tissue regeneration after brain ischemia, and propose astroglia as a possible pharmacological target.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia. Sus principales características histopatológicas son las placas de amiloide ß (Aß) y los ovillos neurofibrilares de tau. La producción y agregación excesivas de Aß pueden desencadenar el depósito de tau y la neuroinflamación, lo que conduce a una neurotoxicidad generalizada y síntomas de demencia. La neuroinflamación juega un papel clave en la progresión de la EA, con mediadores de la inflamación, especialmente la microglia, que promueven la liberación de citoquinas, el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial, la pérdida de sinapsis y la muerte neuronal.En este trabajo, nos centramos en la resolución de la inflamación y la función microglial para estudiar la patología y el tratamiento de la EA, utilizando modelos in vitro e in vivo. Además, desarrollamos un co-cultivo triple con neuronas, microglia y astrocitos para estudiar la comunicación celular en la patología y la neurodegeneración derivadas del Aß.En primer lugar, estudiamos cómo el uso de lipoxinas para promover resolución de la neuroinflamación podría ser beneficioso para la EA. Descubrimos que las lipoxinas disminuyeron la generación de ROS inducida por Aß y restauraron la función mitocondrial. Las lipoxinas también redujeron la acumulaciónde amiloide, la patología de tau y la activación glial en un modelo de ratón con AD, y evitaron la pérdida de sinapsis y la disfunción mitocondrial. Estos resultados sugieren que las lipoxinas son candidatos terapéuticos interesantes para reducir la patología y la progresión de la EA.En segundo lugar, analizamos el receptor del complemento CR3 en microglia, utilizando el inhibidor XVA143. La inhibición de CR3 alteró la morfología celular y redujo la capacidad de migración microglial. También alteró la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune, incluidas las citoquinas y el sistema del complemento. CR3 parece desempeñar un papel clave en la función microglial, y se requiere más investigación para comprender cómo este receptor afecta a la patología deEA mediada por microglia.Por último, establecimos un modelo de triple cultivo para estudiar la comunicación celular. En este triple co-cultivo, las neuronas tenían una morfología más compleja, la microglia era menos inflamatoria y los astrocitos eran menos reactivos en comparación con los cultivos primarios. También pudimos recapitular la patología de Aß, lo que nos permitirá estudiar los procesos de neurodegeneración y neuroinflamación relevantes para la EA en futuros estudios.

Oligodendrocytes make myelin and support axons metabolically with lactate. Experience and neuronal activity can induce dynamic changes in myelination during development and in adult life, suggesting a new form of plasticity to adapt brain function to environmental stimuli. Myelin remodelling is driven mainly by newly-formed oligodendrocytes from precursors cells. However, the role of mature oligodendrocytes in plastic changes of myelin is practically unknown. We have generated transgenic mice, using the CreERT2-lox technology, overexpressing the DREADD receptor hM3Dq under the PLP promoter, specific of mature oligodendrocytes. Chronic stimulation of hM3Dq receptors induced an increase in myelination of axons in cerebral cortex and corpus callosum, and consequently, an increase in axonal conduction velocity of interhemispheric callosal connections. Importantly, acute stimulation of hM3Dq+ activates metabolism in oligodendrocytes that maintained axonal function under high frequency stimulation and prevented axonal damage secondary to oxygen glucose deprivation. Mature oligodendrocytes stimulation promoted remyelination and protected axons in demyelinating disease models. Our data show that pharmacogenetic oligodendrocyte stimulation ameliorates motor symptoms of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis, a model of multiple sclerosis. Taken together, these findings indicate that this pharmacogenetic mouse line is a very useful tool to elucidate the contribution of mature oligodendrocytes to myelin remodeling in physiological and pathological conditions, and reveals a novel role of myelin-axon lactate shuttle in axonal protection.

La compartimentalización es clave para que células polarizadas como las neuronas y la glía mantengan dominios subcelulares estructural y funcionalmente definidos. Esta compartimentalización implica la distribución asimétrica del proteoma celular, en la cual el transporte de mRNAs y su traducción local en dominios subcelulares, conocido como síntesis local de proteínas, juega un papel importante. Se estima que el 50% del proteoma neuronal se genera a través de la traducción de mRNAs localizados, por ello, la desregulación de dicho mecanismo es perjudicial para las funciones neuronales, como se ha observado en algunas enfermedades neurodegenerativas.Las interacciones neurona-microglía son cruciales para el buen funcionamiento neuronal y modulan el proteoma que rige el comportamiento de las neuronas en diferentes contextos celulares. Dado que el proteoma subcelular puede regularse a través de la traducción local del mRNA, uno de nuestros objetivos ha sido determinar si la microglía afecta la síntesis local de proteínas en las neuritas tanto en condiciones fisiológicas como en la patología inducida por el péptido ß amiloide. Mediante el marcaje de proteínas sintetizadas de novo hemos observado que la presenciamicroglía regula la producción de proteínas neuríticas tanto mediante factores secretados al medio extracelular como mediante el contacto directo con las neuritas. Además, los estudios de perfiles proteómicos identificados por espectrometría de masas han corroborado estas observaciones y nos han permitido identificar proteínas reguladas por la presencia de la microglía tanto en condiciones basales como tras el tratamiento con Aß. Estos estudios apuntan a la importancia de la comunicación microglía-neurona en la función neuronal y su implicación en patologías del SNC.Por otro lado, dado que la síntesis local de proteínas no está restringida a las neuronas y estudios recientes han descrito este fenómeno en células gliales otro de nuestros objetivos ha sido determinar si este fenómeno se produce en los procesos periféricos microgliales y si juega un papel importante en mantener la función microglial. Mediante ensayos de puromicilación y co-localización proteína-RNA hemos observado la existencia de traducción local en procesos periféricos microgliales, como los lamelipodios y los filopodios, en respuesta a la inflamación. Además, ensayos de Puro-PLA e hibridación in situ revelaron la presencia de los tránscritos Actb y Par3, implicados en la polaridad celular, y su traducción localizada ante estímulos de inflamación y degeneración, sugiriendo la importancia de este mecanismo en el comportamiento de la microglía en contextos patológicos.Konpartimentalizazioa funtsezkoa da zelula polarizatuetan, hala nola, neuronetan eta glia zeluletan, egiturazko eta funtzionalki definitutako zelulaz azpiko eremuak izan ditzaten. Zatikatze horrek zelula proteomaren banaketa asimetrikoa eskatzen du, non mRNAak garraiatzeak eta horiek eremu subzelularretan tokian-tokian itzulpenak, proteinen tokiko sintesia deritzona, garrantzia handia duten. Neuronetan proteinen %50a mRNAen tokiko itzulpenaren bidez sortzen dela kalkulatzen da. Horregatik, mekanismo hori desarautzea kaltegarria izan daiteke funtzio neuronaletarako, neuroendekapenezko zenbait gaixotasunetan ikusi den bezala.Neurona-mikroglia elkarrekintzak funtsezkoak dira neuronen funtzionamendu egokirako, eta neuronen portaera zuzentzen duen proteoma modulatzen dute zenbait ingurune zelularretan. Proteoma subzelularra mRNA-aren tokiko itzulpenaren bidez erregulatu daitekeenez, gure helburuetako bat mikrogliak neuritetan ematen den proteinen tokiko sintesian eragina duen zehaztea izan da, bai baldintza fisiologikoetan, bai ß amiloide peptidoak eragindako patologian. De novo sintetizatutako proteinak markatuz, ikusi dugu mikrogliak proteina neuritikoen ekoizpena erregulatzen duela, bai zelulaz kanpoko ingurunera jariatutako faktoreen bidez, bai neuritekin kontaktu zuzena izanez. Gainera, masa-espektrometriaren bidez identifikatutako profil proteomikoen azterketek berretsi egin dituzte behaketa horiek, eta, horri esker, mikrogliaren presentziak erregulatutako proteinak identifikatu ahal izan ditugu, bai oinarrizko kondizioetan, bai Aß bidezko tratamenduaren ondoren. Azterketa horien arabera, garrantzi handia du mikroglia-neurona komunikazioak funtzio neuronalean eta NSZko patologietan duen inplikazioan.Bestalde, tokiko proteinen sintesia neuronetara mugatuta ez dagoenez eta duela gutxi egindako azterketek mekanismo hau zelula glialetan deskribatu dutenez, gure beste helburuetako bat fenomeno hori prozesu periferiko mikroglialetan gertatzen den, eta funtzio mikrogliala mantentzeko garrantzia duen zehaztea izan da. Puromizilazio eta proteina-RNA ko-lokalizazioa saiakuntzen bidez, itzulpen lokala behatu dugu mikrogliaren prozesu periferikoetan, hala nola, lamelipodioetan eta filopodioetan, hanturari erantzuteko. Horrez gain, PuroPLA eta in situ hibridazio probek polaritate zelularrean parte hartzen duten Actb eta Par3 mRNA-en presentzia eta itzulpen lokalizatua erakutsi dute, hantura- eta endekapen-estimuluen aurrean, mekanismo horrek testuinguru patologikoetan mikrogliak duen portaeran duen garrantzia iradokiz.

Las encefalopatías espongiformes transmisibles o enfermedades priónicas son un conjunto de desórdenes neurodegenerativos letales que afectan a los mamíferos. El agente causal de estas enfermedades es el prion o PrPSc, la isoforma patógena de la proteína priónica celular o PrPC. El proceso de malplegamiento de la PrPC en PrPSc puede ocurrir de manera espontánea o adquirida, pudiendo estar ambos eventos modulados por la presencia de polimorfismos. En este respecto, la abundancia de polimorfismos en las PrPC de la familia Cervidae podría dar lugar a la emergencia de nuevas cepas priónicas de caquexia crónica. Con el objetivo de analizar el efecto de los polimorfismos descritos en las PrP de cérvidos sobre el malplegamiento y la emergencia de nuevas cepas, la técnica de la PMSA fue utilizada para la obtención de distintos confórmeros mediante malplegamiento espontáneo in vitro de las rec-PrP de corzo y uapití. Así, un estudio detallado de estos confórmeros confirmó la existencia de diferentes cepas de acuerdo con sus propiedades bioquímicas. Tras demostrar que estos confórmeros presentaban las características propias de los priones bona fide, se llevó a cabo el malplegamiento espontáneo in vitro de todas las variantes polimórficas de las PrP de cérvidos y se evaluó el efecto del residuo 226 y del extremo C-terminal de la PrP en la evolución de las diferentes cepas. En este trabajo se presenta un procedimiento sistemático para modelizar la emergencia y evolución de cepas priónicas basado en el malplegamiento y propagación in vitro de las variantes polimórficas descritas en las PrP de la familia Cervidae, el cual podría ayudar a entender y predecir la formación de nuevos priones de cérvido.

Un evento clave que se desarrolla de forma temprana en la enfermedad de Alzheimer (EA) es el acúmulode las formas oligoméricas del péptido ß-amiloide (oAß) en el cerebro. En este estudio, hemosinvestigado el papel de la citoquina macrophage colony-stimulating factor (MCSF) como modulador dela microglía en un contexto de EA. En cultivos primaries de microglía, hallamos que la activación conMCSF modulaba varias de sus funciones. Observamos que el tratamiento con MCSF potenciaba ladensidad de receptores de la microglía y su expresión de citoquinas, promoviendo un ambienteproinflamatorio. Sin embargo, en presencia del oAß, la microglía reactiva, cambia su perfil a unoantinflamatorio. Además, la internalización y eliminación del oAß aumentaba en presencia de MCSF yesto atenuaba el daño sináptico asociado a oAß en co-cultivos de neurona y microglía.En cultivos organotípicos, mediante microscopía de dos fotones, descubrimos que el tratamiento conMCSF revertía las alteraciones de la morfología y motilidad en la microglía causadas por oAß. MCSFaumentó la capacidad de vigilancia de la microglía y promovía su ramificación. El tratamiento con MCSFdisminuía la micro- y astrogliosis, inducida tanto por oAß como por patología asociada a esta en el ratón5XFAD.Al administrar MCSF en ratones adultos 3xTg-AD, se redujo la patología e inflamación asociada a Aß.Además, se mitigó las alteraciones en la sinapsis en la región CA1 del hipocampo.Finalmente, se observe una reducción de los niveles de MCSF en extractos de tejido de hipocampo depacientes con EA, los cuales venían acompañados del aumento de la expresión de CSF-1R, sugiriendouna alteración en el eje MCSF/CSF-1R durante la patogénesis de la EA.En general, nuestros resultados aportan evidencias que apoyan la hipótesis en la que MCSF promueve unfenotipo más eficiente y protector de la microglía frente al Aß en modelos de EA. La reducción de losniveles de MCSF endógeno en pacientes con EA puede contribuir negativamente a la progresión de EA.Esta tesis doctoral proporciona nuevos conocimientos sobre el papel de la microglía en la progresión dela EA y destaca la importancia de la modulación microglial en la patología de la EA asociada a Aß.

El objetivo del trabajo fue analizar y describir la experiencia subjetiva como padre o madre de un adolescente que haya estado ingresado en una unidad de hospitalización de psiquiatría de niños y adolescentes. Participaron 10 padres y 12 madres en tres grupos focales que se realizaron para la obtención de la información.Del análisis cualitativo de la información emergieron seis categorías, Experiencia antes del ingreso, Experiencia durante el ingreso, y Experiencia después del ingreso, con una organización temporal de las mismas, y, las categorías de Propuestas de mejora, Culpa y Estigma que se encuentran presentes a lo largo de toda la experiencia relatada y modulan en el caso de las dos últimas la experiencia global.Esta investigación cualitativa aporta información sobre la experiencia de los padres de la que no se tiene conocimiento que hubiera sido recogida anteriormente mediante esta metodología en nuestro país. La utilización de esta información podría mejorar la atención a los padres y niños y adolescentes usuarios de las unidades de hospitalización psiquiátrica del niño y adolescente.

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC) y una de las principales causas de discapacidad en adultos jóvenes. La principal característica de la EM es la acumulación de lesiones desmielinizantes en el cerebro y la médula espinal, áreas en las que las vainas de mielina de los axones han sido dañadas, provocando inflamación y degeneración axonal. El deterioro de la vaina de mielina interrumpe el procesamiento de la señalización neuronal, lo que provoca déficits neurológicos. Aunque la etiología de la EM sigue sin estar clara, está ampliamente aceptado que estas lesiones están causadas por linfocitos autorreactivos que migran a través de la barrera hematoencefálica (BHE), promoviendo la activación glial y la neurodegeneración crónica.Los astrocitos son la principal población glial en el SNC. Estas células participan en una amplia gama de funciones en el cerebro durante el desarrollo y en la etapa adulta, incluyendo la homeostasis deiones, el reciclaje de neurotransmisores, la formación y el mantenimiento de la BHE, la señalización inmune, la mielinización y la transmisión sináptica. Las células astrogliales también participan en el mantenimiento, la eliminación y remodelación de las sinapsis durante el desarrollo, el envejecimiento y en situaciones de daño celular. Los astrocitos sufren una pronunciada transformación en situaciones neuropatológicas, denominada astrogliosis reactiva, que implica cambios a nivel genómico, morfológico y funcional específicos para cada contexto. Entre las causas que pueden promover la astrogliosis reactiva se encuentran (i) la liberación de citoquinas pro-inflamatorias en respuesta a una lesión del SNC, (ii) los patrones moleculares asociados a daños (DAMPs), (iii) los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) producidos por una infección microbiana y, (iv) el estrés oxidativo o químico. La microglía es crucial para regular el fenotipo de los astrocitos durante la patología del SNC. Las células microgliales activadas producen gran cantidad de moléculas pro-inflamatorias que promueven el reclutamiento de leucocitos y la citotoxicidad de oligodendrocitos y neuronas. Recientemente, se ha propuesto un mecanismo por el cual la microglía promueve la inducción de una población neurotóxica de astrocitos reactivos, denominada A1, mediante la liberación de diversas moléculas inflamatorias como interleucina-1¿ (IL-1¿), factor de necrosis tumoral-¿ (TNF¿) y el componente del complemento 1q (C1q). Este subconjunto de astrocitos reactivos A1 se caracteriza por la regulación al alza del componente del complemento 3 (C3) y se ha identificado en numerosas enfermedades neurodegenerativas, incluida la EM. Los astrocitos neurotóxicos A1 presentan un perfil transcriptómico marcadamente pro-inflamatorio, pierden funciones astrocíticas fisiológicas, liberan sustancias que dañan a las neuronas y a los oligodendrocitos e inhiben la remielinización. Está bien establecido que la activación de los astrocitos juega un papel importante en la inflamación crónica y el daño neurodegenerativo en la EM y en su modelo murino de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). En modelos experimentales se ha demostrado que modular la función de este tipo celular in vivo previene las respuestas inflamatorias y atenúa el daño neurológico durante la progresión de la enfermedad. En base a estas observaciones se ha postulado que la identificación de los factores que promueven la actividad patógenica de los astrocitos en la EM contribuirá al desarrollo de tratamientos terapéuticos novedosos y más exitosos.Clásicamente, los astrocitos han sido considerados células no excitables, ya que, a diferencia de las neuronas, no generan potenciales de acción. Sin embargo, esta definición no es totalmente correcta, ya que estas células presentan unas dinámicas de calcio (Ca2+) complejas y altamente controladas que son fundamentales para la señalización intracelular y la comunicación intercelular. Los astrocitos responden con elevaciones del Ca2+ citosólico a una amplia variedad de neurotransmisores liberados por las neuronas y, posteriormente, liberan una plétora de moléculas neuroactivas, denominadas gliotransmisores, incluyendo glutamato, ATP, D-serina y GABA. En las células astrogliales, las señales de Ca2+ son dependientes de la actividad celular y regulan directamente las funciones biológicas de estas células, contribuyendo a la integración y el procesamiento de la información sináptica, la modulación de la transmisión sináptica, la plasticidad sináptica y el comportamiento. En varios trastornos neurológicos como en la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica, entre otras, los astrocitos presentan una señalización de Ca2+ desregulada. Sin embargo, el papel que juegan las dinámicas de Ca2+ astrogliales durante la EM se desconoce.El sistema endocannabinoide es un sistema neuromodulador implicado en una gran variedad de procesos fisiológicos, como el movimiento, la memoria y la cognición, el estado de ánimo, el dolor, la regulación de la temperatura y el apetito, entre otros. El sistema endocannabinoide está integrado por los receptores cannabinoides, principalmente receptores cannabinoides de tipo 1 (CB1Rs) y de tipo 2 (CB2Rs), sus ligandos endógenos, denominados endocannabinoides, y las enzimas encargadas de la biosíntesis y degradación de estos compuestos. Los endocannabinoides pueden definirse como ungrupo de mensajeros lipídicos sintetizados a partir de componentes de la membrana celular. Aunque se han identificado varias moléculas, los lípidos N-araquidoniletanolamina (anandamida, AEA) y 2-araquidonilglicerol (2-AG) son los endocannabinoides mejor caracterizados. Ambos se sintetizan bajo demanda, normalmente en respuesta a elevaciones del Ca2+ intracelular. Las principales vías para la biosíntesis de los endocannabinoides 2-AG y AEA implican reacciones catalizadas por las isoformas ¿/ß de la diacilglicerol lipasa (DAGL¿/ß) y la N-acil fosfatidiletanolamina fosfolipasa D (NAPE-PLD), respectivamente. El 2-AG es metabolizado principalmente por las hidrolasas monoacilglicerol lipasa (MAGL), dominio ¿/ß-hidrolasa 6 (ABHD6) y 12 (ABHD12). En cuanto al metabolismo de la AEA, la amida hidrolasa de los ácidos grasos (FAAH) es la principal hidrolasa de la AEA en el tejido nervioso, aunque las acciones fisiológicas de esta y otras N-aciletanolamidas también pueden ser terminadas por amidasas de lípidos alternativas, como la N-aciletanolamina amidasa ácida (NAAA). Recientemente, se han identificado una serie de proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) que actúan como transportadores intracelulares de endocannabinoides, principalmente AEA. Los CB1Rs se expresan predominantemente en el cerebro, mientras que los CB2Rs se localizan principalmente en las células periféricas del sistema inmunitario. Los CB1Rs son uno de los receptores acoplados a proteínas G más abundantes en el cerebro de los mamíferos y median los efectos psicoactivos del cannabis. Las áreas cerebrales con altos niveles de CB1Rs incluyen el hipocampo, la corteza cerebral, los ganglios basales y el cerebelo, donde desempeñan funciones neuromoduladoras relevantes en la fisiología cerebral. En cuanto a la distribución celular de los CB1Rs, estas proteínas se localizan principalmente en las neuronas maduras del SNC. En particular, los CB1Rs se expresan en niveles más altos en neuronas GABAérgicas y en menor medida en neuronas glutamatérgicas del cerebro anterior. La mayoría de los CB1Rs neuronales se encuentran en los terminales presinápticos de los axones y están implicados en el mantenimiento de la homeostasis de las sinapsis, regulando negativamente la liberación de neurotransmisores a través de la inhibición de los incrementos de Ca2+ citosólico que promueven la liberación de neurotransmisores. Por otro lado, la presencia de CB1Rs en las células gliales también ha sido demostrada de forma indiscutible durante la última década. En particular, se ha demostrado que los astrocitos expresan cantidades significativas de CB1Rs que desempeñan un papel crucial en la función astroglial. En especial, juegan un papel importante en la regulación de la función sináptica afectando directamente al comportamiento y la memoria, además de estar crucialmente implicados en la regulación del metabolismo energético. Por otro lado, es bien conocido que tanto astrocitos como microglía participan en la biosíntesis y el metabolismo de los compuestos endocannabinoides. Sin embargo, el papel de las células neurogliales como dianas y mediadores de la señalización endocannabinoide en la EM ha sido escasamente analizado.Hoy en día está bien establecido que los compuestos (endo)cannabinoides exhiben propiedades neuroprotectoras y anti-inflamatorias en la EM mediados por receptores CB1Rs y CB2Rs. Sin embargo, los mecanismos subyacentes y la especificidad celular de los efectos observados no se comprenden completamente. Se ha descrito que los efectos beneficiosos de los agonistas cannabinoides en la EM se deben en parte a la activación de CB1Rs neuronales, que promueven la protección contra la excitotoxicidad por altos niveles extracelulares de glutamato. Esta hipótesis se basa en la observación de que los ratones que carecen de CB1Rs presentan una escasa tolerancia a la excitotoxicidad y desarrollan daños neuronales más graves y síntomas más severos durante la EAE. Por otro lado, los CB1Rs expresados en los astrocitos inducen elevaciones intracelulares de Ca2+ que promueven la liberación de glutamato entre otros gliotransmisores. Este mecanismo está implicado en el deterioro de la memoria asociada al uso de cannabinoides y puede contribuir al desarrollo de un entorno excitotóxico en enfermedades neuroinflamatorias como la EM. Sin embargo, las implicaciones de la señalización endocannabinoide mediada por los astrocitos en la EM son básicamente desconocidas.En el contexto mencionado, el objetivo global de esta Tesis Doctoral es ampliar el conocimiento actual sobre el papel del sistema endocannabinoide en la modulación de los astrocitos en la EM, con especial énfasis en los CB1Rs astrogliales. Nuestros objetivos específicos son los siguientes:Objetivo 1. Investigar posibles cambios en la señalización endocannabinoide en astrocitos y microglía en el contexto de su alteración fenotípica durante la EAE.Objetivo 2. Evaluar el acoplamiento funcional de los CB1Rs a la señalización de Ca2+ intracelular en los astrocitos activados en el contexto de la EAE utilizando enfoques complementarios in vivo e in vitro.Objetivo 3. Evaluar el fenotipo de los ratones mutantes condicionales que carecen de CB1Rs astrocíticos en el modelo EAE utilizando técnicas histológicas, moleculares y de imagen de Ca2+ in vivo.Nuestros resultados muestran que la activación de los astrocitos durante la EAE se asocia a alteraciones transcripcionales tempranas que afectan a numerosas moléculas relacionadas con la señalización endocannabinoide. Además, los astrocitos adquieren un fenotipo neurotóxico asociado a un perfil de expresión génica pro-inflamatorio que sugiere deficiencias en el mantenimiento y/o promoción de las sinapsis, así como en la capacidad de fagocítica de estas células durante el curso temporal de la EAE. En segundo lugar, nuestros resultados identifican los CB1Rs astrogliales como mediadores de los efectos del ¿9-THC sobre la dinámica de Ca2+ citosólico en astrocitos de la corteza somatosensorial del ratón in vivo y muestran una desregulación de la señalización de Ca2+ en estas células, tanto espontánea como en respuesta a estímulos, durante la progresión de la EAE. Por último, los ratones en los que los CB1Rs han sido específicamente eliminados en astrocitos presentan una reducción de la severidad de los síntomas motores y discapacidad neurológica durante el curso temporal de la EAE. A nivel histológico, estos animales exhiben menor área desmielinizada y número de lesiones desmielinizantes, junto con una menor infiltración de linfocitos T, un descenso en la reactividad astroglial y una reducción del daño neuroaxonal. Este fenotipo protector se acompaña de descensos en la expresión de genes relacionados con señales pro-inflamatorias, con la activación y el reclutamiento de linfocitos T y con el fenotipo astroglial neurotóxico A1, así como con aumentos en los niveles de marcadores sinápticos/neuronales. Finalmente, la deleción de CB1R astroglial se asocia a una menor desregulación de las dinámicas de Ca2+ astroglial durante la EAE. Por tanto, nuestros datos sugieren que los CB1Rs astrocíticos exacerban la discapacidad neurológica y la neuroinflamación durante la EAE, señalando un papel previamente desconocido del sistema endocannabinoide en la fisiopatología de la mielina.Las principales conclusiones de nuestro estudio son las siguientes:I. Los astrocitos incrementan la expresión de genes asociados al fenotipo neurotóxico durante la progresión de la EAE, apoyando así un papel patogénico de este subconjunto de astrocitos reactivos en la EM. Por otro lado, la microglía muestra un estado de polarización intermedio en cuanto a la expresión de genes inflamatorios durante la EAE.II. Los astrocitos y la microglía activados durante la desmielinización autoinmune muestran alteraciones transcripcionales específicas a nivel celular que afectan a las moléculas asociadas al sistema endocannabinoide y que sugieren una desregulación de este sistema de señalización en ambos tipos celulares en la EM.III. Los astrocitos corticales muestran déficits de señalización de Ca2+ espontánea y evocada por estímulos durante la EAE que se correlacionan en parte con la discapacidad neurológica.IV. Los astrocitos activados in vitro e in vivo muestran cambios en la expresión génica de moléculas relacionadas con la señalización de Ca2+, así como respuestas citosólicas de Ca2+ alteradas al glutamato y al ATP que pueden contribuir a los déficits de señalización de Ca2+ observados in vivo.V. La activación de los CB1Rs astrogliales provoca respuestas robustas de Ca2+ citosólico en astrocitos corticales in vivo que se encuentran disminuidas durante la EAE. En el contexto de estudios anteriores, estas observaciones sugieren déficits en la comunicación entre astrocitos y neuronas mediada por endocannabinoides que contribuirían a cambios en la comunicación sináptica en la EM.VI. La supresión genética de los CB1Rs en los astrocitos atenúa la severidad de la EAE y previene los déficits de señalización de Ca2+ asociados a la progresión de la enfermedad a través de mecanismos que pueden implicar la modulación del reclutamiento de células T y microglía/macrófagos y la conversión neurotóxica de los astrocitos.En conjunto, estos hallazgos amplían el conocimiento existente sobre los mecanismos que median los beneficios/efectos secundarios de los tratamientos cannabinoides en la EM y sientan las bases para futuras investigaciones dirigidas a desarrollar nuevos fármacos moduladores del sistema endocannabinoide más eficaces para tratar esta enfermedad neurológica.

Esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio del efecto de la hiperglicemia en un modelo animal de hemorragia subaracnoidea aneurismática mediante técnicas de tomografía por emisión de positrones (PET) y resonancia magnética (MRI). Se han evaluado diversos aspectos como la aparición de edema e infarto, el volumen de hemorragia, la rotura de la barrera hematoencefálica, la inflamación y el estrés oxidativo. Finalmente, se evaluó el efecto antioxidante del ácido úrico en animales hiperglicémicos con hemorragia subaracnoidea.

The extracellular space (ECS) is a highly complex space consisting of narrow interconnected channels and reservoirs. The ECS substructures are usually few nanometers wide and consequently, they are very difficult to visualize. In addition, the brain ECS is a very dynamic structure, that changes at different temporal scales. These structural changes can be physiological or they can have a pathological cause. In fact, astrocytic swelling at the expense of the ECS volume is one of the hallmarks of epilepsy. Particularly, we are interested in how ECS volume changes affect GABAergic inhibition, the main source of inhibition in the brain and one of the most studied processes in the onset of epileptogenesis.On the other hand, most intercellular signalling in the brain occurs by diffusion of particles through the ECS channels. Understanding how diffusion is regulated by the fine geometry of the brain neuropil is becoming the focus of interest for researchers. However, progress in this field is limited by the difficulty to access local ECS diffusion with experimental techniques. Recently developed techniques, such as super-resolution shadow imaging (SUSHI), are opening the doors to understand diffusion of molecules through the brain sub-micron ECS structures. In this study, we aim to investigate how the nano-scale ECS geometry of the live brain tissue shapes the diffusion of transmitters and its impact on cellular communication. To attain this goal, we have developed a novel computational model, based on SUSHI images.

La degeneración de la mielina y la pérdida de sustancia blanca son eventos tempranos en la enfermedad de Alzheimer (EA) que conducen a déficits cognitivos. Uno de los rasgos distintivos de la EA es la presencia de agregados extracelulares del péptido beta amiloide (AB), y se ha propuesto que los oligómeros de AB (ABo) inducen cambios en los oligodendrocitos y la mielina. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. En esta tesis doctoral, describimos que el metabolismo del ARN y la traducción, entre otros, son mecanismos significativamente afectados en oligodendrocitos in vitro tratados con los y en el ratón triple transgénico modelo de la enfermedad in vivo. En concreto, los oligodendrocitos expresaron niveles elevados de la proteína básica de la mielina, y esta alteración provocó cambios significativos en la homeostasis de calcio oligodendroglial, en la composición de la vaina de la mielina y en la morfología del citoesqueleto de la actina. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral muestran que los Aßo cambian la proteostasis oligodendroglial influyendo en la dinámica de la maduración de los oligodendrocitos y en la vaina de mielina, con posibles consecuencias para la conducción axonal.

Las células están constantemente moviendo material como parte de su inherente actividad e interacciones con el entorno. La red endosomal es un foco de redistribución de moléculas. Esta red recibe proteínas transmembrana, como receptores y canales, denominados cargo, de la vía secretora y endocítica, que son dirigidos a lisosomas para su degradación o reciclados para su reutilización. El reciclaje de proteínas tiene un impacto directo sobre el equilibrio metabólico y la homeostasis celular, y se ve perturbado durante el envejecimiento. De todo el cargo que llega a los endosomas, alrededor de dos tercios es reciclado y reutilizado a través de distintas vías. La variedad de cargo que es reciclado repercute en una amplia gama de procesos fisiológicos como la ingesta de nutrientes, la señalización celular, el transporte polarizado, la diferenciación celular, la respuesta inmune y la transmisión nerviosa. Cada vía de reciclaje utiliza complejos moleculares específicos con composiciones e interacciones definidas. Sin embargo, los mecanismos que regulan el ensamblaje de estas maquinarias, el acoplamiento del cargo y la deformación de las membranas han permanecido prácticamente inexplorados. Por ello, en este trabajo hemos estudiado diversos mecanismos reguladores de la actividad del retrómero.

La demencia frontotemporal (DFT) es un trastorno neurodegenerativo y la segunda causa de demencia, queafecta en general a pacientes menores de 65 años que presentan alteraciones predominantementeconductuales y o de, lenguaje. La mayoría de los casos de FTD son esporádicos, pero hasta un 40% de lospacientes tienen antecedentes familiares de demencia, y un 10% se presentan con rasgos de transmisiónmendeliana. Las mutaciones en diferentes genes, como la proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT),la granulina (GRN), la proteína de unión al ARN FUS (FUS), la proteína que contiene valosina (VCP) y lasubunidad del complejo C9orf72-SMCR8 (C9orf72), son los genes más frecuentemente implicados en lasformas familiares de DFT (DFTf). De entre ellas, las mutaciones en el gen GRN representan el 5-20% deltotal de casos de DFTf. Estas mutaciones en heterozigosis conducen a una haploinsuficiencia de la proteínacodificada, progranulina (PGRN), por truncamiento de la misma, lo que desencadena el procesoneurodegenerativo. En 2008, se describió una forma familiar de DFT en un grupo de familias vascas queeran portadoras de una mutación genética ancestral (c.709-1G>A) en el gen GRN.La demencia frontotemporal con mutaciones de progranulina (FTD-GRN) cursa con una ciertaheterogeneidad clínica que se pueden solapar con otros procesos neurodegenerativos que cursan condemencia y que se manifiesta en una variabilidad de la forma de presentación clínica, edad de aparición ycurso clínico lo que dificulta el consejo genético en sujetos a riesgo. Por ejemplo, la edad de inicio puedeoscilar entre los 35 y los 89 años, y la duración de la enfermedad oscila entre los 3 y los 22 años, inclusodentro de la misma familia. Las razones de esta heterogeneidad no son bien conocidas, pero seguramenteson debidas a la interacción epistática con otros genes (protectores o agravantes), a mecanismosepigenéticos y posiblemente a causas ambientales o de estilos de vida que influyen en el procesoneurodegenerativo.Además de los rasgos clínicos más o menos característicos de este tipo de DFT, se han encontradodiferentes biomarcadores asociados a la condición o a la progresión de la condición. Estos biomarcadoresson esenciales para restablecer estadios de la enfermedad y monitorizar la progresión de la enfermedad,establecer un pronóstico y resultarán cruciales para establecer en un futuro próximo, la eficacia de lasterapias. Algunos de estos biomarcadores analizados en el LCR, como NPTX2 y NfL permiten diferenciara los individuos presintomáticos que inician la fenoconversión a un fenotipo DFT.Desde un punto de vista neuropatológico la DFT- GRN se caracteriza por la presencia de depósitos de laproteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43), que se presenta en forma de inclusiones citoplasmáticas enneuronas y glía. Además, en el cerebro de los pacientes con DFT-GRN se encuentran otros rasgosneuropatológicos específicos, como la acumulación de gránulos de lipofuscina, y depósitos lisosomas queaportan pistas sobre la fisiopatología que conduce desde la haploinsuficiencia de PGRN a laneurodegeneración. Estas acumulaciones son similares a las que se encuentran en un grupo deenfermedades neurometabólicas de base hereditaria conocidas como ceroidolipofucsinosis (CLPF). Losportadores de mutaciones en estado de homozigosis o de heterozigosis compuesta presentan ademas de uncuadro clínico más grave que en los casos de heterozigotos, depositos de lipofucsina, similares a las CLPF.El PGRN es una glicoproteína secretada compuesta por 7,5 segmentos de granulina (granulina A-G, yparagranulina) que desempeña un papel importante en numerosos procesos celulares. Aunque la funciónprecisa de la PGRN sigue sin comprenderse del todo, las granulinas individuales pueden cumplir funcionesdiversas e incluso opuestas en comparación con la PGRN de longitud completa. Es importante destacar quecada vez son más contundentes las pruebas de un papel fundamental de la PGRN en la función lisosomal.Intracelularmente, la PGRN de longitud completa se localiza predominantemente en el lisosoma, y esescindida proteolíticamente por proteasas lisosomales, dando lugar a la producción de péptidos individualesde granulina. Se cree que estos péptidos son activos para regular determinados enzimas lisosomales, comola catepsina D o la glucocerebrosidasa (GCasa). Además, el gen GRN contiene dos secuencias potencialesde expresión y regulación lisosomal coordinada (CLEAR) para interactuar con el factor de transcripciónEB (TFEB). El TFEB controla la expresión de genes lisosomales en respuesta a las necesidades lisosomalesderivadas del aumento de la demanda de nutrientes durante la inanición (STV) inducida por la inhibiciónde la Serina/treonina-proteína quinasa mTOR (mTOR). En consecuencia, y tomando tanto los datosneuropatológicos como los moleculares es plausible postular que la disfunción lisosomal pueda ser el factorfundamental que desencadena la neurodegeneración y la muerte neuronal en la DFT-GRN.El lisosoma es una organela celular con un papel preponderante en el desecho y reciclaje celular, en la regulación centralizada de la detección de nutrientes y en la reconfiguración del metabolismo de la célula en respuesta a la demanda de energía, para mantener la homeostasis celular y asegurar la supervivencia. Para cumplir este abanico de funciones vitales para la célula, el lisosoma interactúa con otras organelas celulares intercambiando contenido e información mediante el establecimiento de puntos de contacto con la membrana de esas organelas como la mitocondria o el retículo endoplásmico. Por ejemplo, el lisosoma ejerce un importante mecanismo de control metabólico facilitando el control de calidad de las mitocondrias a través de la mitofagia, que implica la eliminación selectiva de mitocondrias disfuncionales. El mantenimiento del homeostasis energético a cargo de las mitocondrias en las neuronas depende en gran medida de la mitofagia, regulada por los lisosomas.La capacidad de las células para adaptarse y reconfigurar la utilización de nutrientes en función de necesidades energéticas y disponibilidad de los mismos es otro factor clave en el mantenimiento del equilibrio metabólico, Cuando escasean los nutrientes la reconfiguración metabólica que implica un desplazamiento de la glucólisis hacia la ß-oxidación mitocondrial de los ácidos grasos (AG) que se originan a partir del triacilglicerol (TAG) almacenado o de los ésteres de colesterol dentro de las gotas lipídicas (LD) es fundamental para optimizar la producción de energía. Durante el estrés energético por carencia de nutrientes, la macroautofagia se potencia para reciclar los componentes celulares y suministrar a la célula los constituyentes esenciales para priorizar los procesos biológicos vitales. Dentro del lisosoma, los lípidos de membrana se descomponen en AG y se liberan. Estos AG pueden servir como fuente de producción de energía para las mitocondrias o ser reesterificados y empaquetados en nuevos LDs en el retículo endoplásmico, dando lugar a un aumento paradójico de los LDs. Este mecanismo pretende hacer frente a la afluencia excesiva de AF al citoplasma y prevenir la lipotoxicidad.Por lo tanto, las alteraciones funcionales de los lisosomas tienen el potencial de afectar al homeostasis celular durante periodos de demanda energética al menos a dos niveles diferentes: en primer lugar, impidiendo la disponibilidad de AG como fuente alternativa de combustible y, en segundo lugar, aumentando el riesgo de acumulación de desechos celulares procedentes del mal procesado de organelas como las mitocondrias disfuncionales. Una característica común que comparten las mitocondrias y los lisosomas es que las alteraciones en las enzimas de estos organelas a menudo son causa de enfermedades neurológicos bien por depósito o bien por insuficiencia energética en un tejido sin capacidad de renovación y muy demandante de energía.El objetivo de la primera parte de la disertación doctoral es estudiar si la haploinsuficiencia de PGRN asociada a la FTD-GRN, puede conducir a una alteración en la comunicación entre el lisosoma y las mitocondrias, con consecuencias perjudiciales a nivel metabólico.Por otro lado, si estos procesos son los precursores de la neurodegeneración, resultara crucial detectar si estos procesos pueden ser monitorizables con biomarcadores de proceso que puedan servir de diana de procesos terapéuticos cuya eficacia depende de la precocidad de su aplicación. Por otro lado, la identificación de biomarcadores en fases tempranas del proceso que pronostiquen la fenoconversión clínica, van a resultar indispensables para analizar la respuesta biológica a los tratamientos.Para este segundo objetivo y de cara a que dichos biomarcadores puedan ser de facil implementación en clínica hemos centrado la segunda parte de esta tesis en el estudio del transcriptoma en sangre periférica. Los tejidos periféricos, en particular la sangre, ofrecen una ventana a los cambios dinámicos y momentáneos en el perfil molecular de un individuo, aunque es posible que sean sutiles y difíciles de captar con algunas tecnologías. Para ello hemos desarrollado un panel de biomarcadores tempranos para ser detectados en suero mediante PCR cuantitativa. En esta parte del trabajo intentamos determinar si estos biomarcadores derivados del conocimiento de los eventos moleculares precoces predicen con exactitud el estado prodrómico o sintomático de los pacientes con FTD con mutaciones GRN.Para abordar estos objetivos, en la primera parte utilizamos fibroblastos de poel obtenidos de pacientes con DFTf portadores de la mutación distintiva de GRN (c.709-1G>A) hallada en nuestra población. Investigaciones previas del grupo y de diferentes colaboradores nos han permitido validar la utilidad del modelo que muestra acumulación lisosomal y de lipofuscina, aunque la patología TDP-43 estánotablemente ausente. Estos fibroblastos presentan un significativo deterioro de la función lisosomal que conduce a una acidificación reducida y a un flujo autofágico comprometido. También son evidentes las anomalías mitocondriales, caracterizadas por un aumento de la mitofagia y una respiración disfuncional. Es importante destacar que el tratamiento con progranulina humana recombinante (rhPGRN) ha mostrado capacidad de rescate, restaurando la acidificación lisosomal y mitigando ciertos defectos mitocondriales. Además, los fibroblastos FTD-GRN muestran un metabolismo lipídico anormal, con una mayor formación de gotas lipídicas que puede recuperarse igualmente mediante el tratamiento con rhPGRN. En particular, en condiciones ricas en nutrientes, la dinámica de las gotas de lípidos está determinada tanto por la autofagia como por los procesos mitocondriales, posiblemente debido a una oxidación deficiente de los ácidos grasos.En conjunto, estos hallazgos sugieren una asociación directa entre la deficiencia de GRN y las interacciones alteradas entre lisosomas y mitocondrias, lo que influye en el metabolismo energético y contribuye potencialmente a la patogénesis de la FTD.En conclusión, la haploinsuficiencia del gen GRN, además de la disminución de la función lisosomal, induce alteraciones en el metabolismo celular, afectando tanto al homeostasis mitocondrial como a la lipídica. Estas alteraciones metabólicas, que surgen como manifestaciones secundarias de la disfunción lisosomal relacionada con el GRN son recuperables con tratamiento con rhPGRN.Para abordar los objetivos de la segunda parte realizamos un análisis de expresión génica a gran escala utilizando el microarray Human Gene 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) en ARN total extraído de leucocitos de sangre periférica de 8 parientes no portadores y 17 pacientes reclutados del registro vasco FTD-GRN del Hospital Universitario Donostia. Las muestras se clasificaron en cuatro grupos en función del estadio clínico y de la determinación por los niveles de cadena ligera de neurofilamentos. Para ello, hemos empleado el Análisis Lineal Mixto Generalizado (GLMA), el Análisis de Clases Latentes (LCA) y el Análisis Lineal Discriminante (LDA) para la exploración de estos datos.Nuestro análisis reveló 200 genes expresados diferencialmente (DEGs) en los grupos No convertidores, Convertidors y Sintomático en comparación con los No Portadores. Aplicando el análisis de clases latentes (ACL), priorizamos 152 DEG que mostraban tendencias significativas a lo largo del continuo de la enfermedad. En particular, surgieron dos genes con un fuerte potencial discriminatorio. Un clasificador basado en LDA que utilizó estos genes mostró una excelente discriminación entre individuos No Convertidores y Convertidores (AUC=1,0). La validación mediante PCR cuantitativa (qPCR) reveló sutiles diferencias en la expresión génica, pero el clasificador basado en LDA mantuvo un notable grado de discriminación (AUC=0,8056). Estos dos genes resultan prometedores como biomarcadores tempranos de la conversión FTD-GRN.En conclusión, nuestra identificación de dos mRNAs detectables por qPCR con potencial combinado para diferenciar individuos No Conversores y Conversores, así como para predecir la aparición de síntomas en un plazo de 2 años, tiene una relevancia clínica significativa. Estos biomarcadores tienen el potencial de mejorar los ensayos clínicos y las estrategias de intervención temprana para pacientes con FTD-GRN. Sin embargo, se justifican investigaciones adicionales en una cohorte más amplia para continuar explorando la asociación de estos biomarcadores con los mecanismos fisiopatológicos en la FTD-GRN.

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system that continuously monitor the brain parenchyma. They participate in many processes, including the phagocytosis of apoptotic cells. Indeed, microglia also play a key role in adult neurogenesis through their phagocytic ability, where they remove apoptotic newborn cells, but also secrete factors that actively regulate adult neurogenesis (AHN). Both AHN and microglia are also influenced by numerous factors ranging from lifestyle to pathology, such as omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and autism spectrum disorder (ASD). Given the interplay between microglia and AHN in physiology, and the influence of PUFAs and ASD on both, this PhD thesis postulates that microglia regulate AHN in these pathological scenarios, possibly through their phagocytic activity. Since microglial phagocytosis is impaired in several brain disorders, we also developed a bottom-up strategy to identify potential pharmacological modulators. In the first part, we manipulated the dietary intake of omega-6 and omega-3 PUFA in mice in order to study their influence on AHN and microglia. We found that the balance between these fatty acids affects AHN and microglia in a sex-dependent manner. Specifically, female mice were more sensitive to PUFA levels in AHN. In the second part, we investigated the effect of a genetic mouse model of ASD (neuroligin 4 knockout mice) on neurogenesis and microglia at different developmental stages. We observed that in mice lacking neuroligin 4, AHN and microglia were increased in a sex-dependent manner at 4 and 13 weeks of age. Specifically, while males showed increased AHN and microglia at 4 weeks of age, females showed this phenomenon at 13 weeks of age. However, we did not observe any effect on microglial phagocytosis due to the deletion of neuroligin 4, which did not support our hypothesis that the effects on AHN might be mediated by phagocytosis. Finally, we took an independent approach to identify potential compounds that enhance or block phagocytosis. To this end, we developed a strategy in which the biological complexity of the system was increased at each step. From a large set of initial compounds, we found two that strongly inhibited microglial phagocytosis of apoptotic cells in organotypic cultures and in vivo: trifluoperazine and compound #1, which shows that our strategy is a valuable tool for identifying potential modulators of phagocytosis. Overall, these results highlight the relationship between AHN and microglia in different scenarios, and also indicate new potential pharmacological strategies to modulate phagocytosis in pathologies where it is dysfunctional.

Epilepsy is a common neurological disorder, which lacks a comprehensive understanding of epileptogenesis. Temporal lobe epilepsy (TLE) in particular, often involves the hippocampus, with gliosis and abnormal neurogenesis. In our study, we aimed to evaluate and mitigate abnormal neurogenesis in TLE using an ex vivo model of hyperexcitable hippocampal organotypic culture slices (hOTCs) with disrupted GABAergic transmission by picrotoxin (PTX). Here, we observed that the epileptiform environment in hOTCs reduced newborn neuron density and impaired dendritic growth. Additionally, inhibiting newborn neurons restored normal firing patterns, indicating a link between neurogenesis and network activity. When we therefore targeted neuroinflammation in epileptogenesis through ATP signaling pathways by blocking purinergic receptors (P2XRs) or by reducing oxidative stress with cerium oxide nanoparticles, we observed recovery in most of the features studied. However, recovery in dendritic arborization occurred with P2XR inhibition but not in oxidative stress reduction. As a general conclusion, we observed that modulating ATP signaling prevented epileptiform activity, showcasing the importance of ATP and ROS in neurogenesis.

El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad crónica y de afectación sistémica que afecta a múltiples órganos, inclusive el sistema nervioso central (SNC) y periférico (SNP). Dentro de los síntomas clínicos característicos de la enfermedad, la presencia de alteraciones neuropsiquiatricas ha sido ampliamente descrita. Nuestros resultados señalan la presencia de una menor prevalencia de cuadros afectivos de lo inicialmente descrito en la literatura a través de una evaluación clínica llevada por un especialista en salud mental. Del mismo modo, la prevalencia de afectación cognitiva fue menor de la reportada en la literatura, a través de una evaluación neuropsicológica exhaustiva y teniendo en cuenta la definición de criterios operativos de afectación cognitiva. Cabe mencionar que estos resultados podrían estar influidos por la baja actividad sistémica y el limitado daño orgánico acumulado en la población evaluada, así como por el uso de dosis bajas de fármacos glucocorticoides. No obstante, a pesar de esta estabilidad clínica aparente, se observó que la presencia de trastornos depresivos tenía un impacto significativo en la calidad de vida y en la capacidad funcional diaria de las personas con LES. En lo que respecta al análisis de los parámetros analíticos, se observa la presencia de un perfil diferenciado en pacientes con LES y patología depresiva comorbida. Este perfil se caracteriza por la elevación de marcadores como la proteína C reactiva (PCR) y la proteína S100b, así como una disminución significativa en los niveles de colesterol HDL. Es importante destacar que esta disminución del colesterol HDL está específicamente asociada a la patología depresiva. Adicionalmente, se observó una reducción en los niveles de enolasa neuronal especifica (NSE) en pacientes con LES y patología depresiva, asociada a la presencia de daño astrocítico y glial del SNC. En conjunto, estos hallazgos refuerzan la compleja interacción entre el sistema inmunológico, la patología depresiva y el LES, proporcionando una visión más completa de la manifestación clínicas comórbidas en patología autoinmune.

Esta tesis doctoral se centra en una de las principales funciones de la microglía, la fagocitosis de material biológico en el parénquima, específicamente en la fagocitosis de células apoptóticas. El sistema-modelo del nicho neurogénico hipocampal ha sido ampliamente estudiado en nuestro laboratorio revelando que la fagocitosis de células apoptóticas no es un proceso terminal, ya que repercute en su entorno, regulando la neurogénesis hipocampal. Estos resultados previos nos llevan a especular que la fagocitosis desencadena cambios en diferentes niveles de microglía, potencialmente afectando su estado transcripcional, metabólico y, en consecuencia, su función fagocítica.

El Trastorno del Espectro Autista (TEA) es un desorden del neurodesarrollo caracterizado por la presencia de déficits sociales y comunicativos, así como la presencia de comportamientos repetitivos e intereses restringidos. Actualmente presenta uno de los principales problemas de salud en el mundo debido a su alta incidencia, 1 de 54 niños son diagnosticados con autismo en USA. Estudios tanto en humanos como en modelos animales, han servido para identificar alteraciones en diferentes áreas cerebrales. Una de las áreas que en la que las alteraciones están presentes con mayor consistencia en el autismo es el cerebelo. Pese a ello, sigue siendo una estructura olvidada en el abordaje de este desorden. Usando un modelo murino de autismo carente de la proteína Cntnap2, el objetivo de la presente tesis doctoral ha sido la caracterización de esta estructura desde un punto de vista neuroanatómico y funcional, así como el estudio del papel que desempeña esta proteína en el cerebelo a la hora de controlar los déficits comportamentales presentes en el autismo. Para ello se han usado técnicas electrofisiológicas in-vivo, in-vitro, así como técnicas comportamentales. Revelando la importancia de esta proteína para un correcto funcionamiento de las neuronas cerebelares, así como para la integración de información sensorial por parte del circuito cerebelar.

The dynamic properties of dendritic spines are crucial for the modulation of synaptic strength and plasticity. While most experimental efforts have explored dendritic spines in response to specific events such as synaptic plasticity or in various neurological disorders, the potential role of structural spine neck changes in regulating neuronal function remains obscure. It appears likely that dendritic spines can independently regulate signal transduction, particularly the magnitude of postsynaptic potential, via its neck. Here, we induced modest hyperexcitation in mouse hippocampal slices using the GABAA receptor blocker picrotoxin (PTX) to identify the earliest functional adjustments in the hippocampal circuit. After 30 minutes of PTX treatment, we investigated the intrinsic membrane and dendritic spine structure in CA1 pyramidal neurons. Modest hyperexcitation, without sustained discharging, did not induce changes in intrinsic neuronal properties. However, we did observe subtle changes in dendritic spine shape that may impact signaling independently of synaptic release and post-synaptic receptor mechanisms. Our ongoing efforts will explore whether these changes reflect a beneficial homeostatic response to maintain the balance or contribute to a slow shift in the excitation/inhibition balance.

Our research focused on MCT2, a key transporter of lactate and other monocarboxylates essential for brain metabolism. We found MCT2 expression in oligodendroglial cells throughout development and in remyelinating cells in mice and human cerebellum. In MS, MCT2 expression by oligodendrocytes was reduced.Using mouse models, we deleted MCT2 in adult oligodendrocytes, resulting in myelin loss and mild inflammation without cell death. Glucose deprivation in vitro affected immature oligodendroglial cells, while L-lactate supplementation rescued MBP levels and process maintenance. Besides, OPC pure cell culture confirmed MCT2 expression.Deleting MCT2 in OPCs during adult myelin regeneration, impaired oligodendrocyte differentiation, suggesting its role in myelin maintenance and repair mechanisms, relevant to MS pathology.

El cerebro de la mayoría de las especies de mamíferos es capaz de generar nuevas neuronas a lo largo de la vida adulta; mediante un proceso denominado neurogénesis adulta. La acumulación de evidencias en los últimos años, apunta a que en cerebro humano también persiste la neurogénesis adulta. Las dos regiones principales donde se forman nuevas neuronas, a partir de células madre neurales (neural stem cells, NSCs), son la zona subventricular de los ventrículos laterales cerebrales y la zona subgranular del giro dentado del hipocampo. En esta última, el proceso se denomina neurogénesis hipocampal adulta y está implicada en funciones como el aprendizaje, la memoria y el control del estrés y la ansiedad. Cualquier alteración de la cascada neurogénica hipocampal puede comprometer estas funciones cognitivas del hipocampo. Dado que la neurogénesis hipocampal es muy vulnerable a los cambios en la actividad neuronal, especialmente a la hiperexcitación neuronal, el presente trabajo se centra en la epilepsia del lóbulo temporal medial (mesial temporal lobe epilepsy, MTLE), que afecta al hipocampo y a áreas estrechamente conectadas con él, como la amígdala. Los objetivos de este trabajo se basan en la implementación y caracterización de distintos modelos murinos de MTLE y en el tratamiento de éstos con distintas sustancias con potencial terapéutico. El propósito es evitar las alteraciones de la cascada neurogénica hipocampal; tanto a nivel de las NSCs, como de las neuronas inmaduras y maduras que permanecen remanentes, y se vuelven aberrantes.

Amyloid ß oligomers (Aßo) induce oligodendrocyte and myelin dysfunctions in early stages of Alzheimer's disease, which contribute to cognitive deficits. Oligodendrocyte differentiation and myelination processes are tightly regulated by several transcriptional factor, among which Myelin Regulatory Factor (MYRF) is essential. However, MYRF¿s role in Alzheimer¿s disease remains poorly understood. In our study, we observed promoted oligodendrocyte differentiation and maturation in the corpus callosum and the dentate gyrus of both 3xTg-AD and Aßo-injected WT mice, in addition to brain region-specific oligodendrocyte cell death in the dentate gyrus of the 3xTg-AD mice. Additionally, Aßo exposure increased MYRF protein levels both in vivo and in vitro. We describe, for the first time, an Aßo-induced aberrant signaling pathway for MYRF degradation, with functional implications for oligodendrocytes and myelin in Alzheimer¿s disease models. Furthermore, we validate PKC inhibition as a potential pharmacological strategy to mitigate these disruptions in zebrafish and murine models.

In this doctoral thesis, we have identified the differentiation mechanisms influenced by GABAB receptor (GABABR) in oligodendrocytes and we have examined its potential for (re)myelination. First, we evaluated the consequences of GABABR modulation in cultured oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), using GABABR agonist baclofen or antagonist CGP. Baclofen promoted OPC differentiation and myelination in vitro, whereas treatment with CGP reverted this effect. In order to identify the signaling pathways triggered by GABABR activation, we performed immunoblot analysis to determine the phosphorylation state of relevant mediators of OPC differentiation. Indeed, baclofen treatment regulated the activation of PKC, CREB, p38¿, Akt and Src. Considering the robust effect mediated by baclofen in cultured oligodendrocytes, we next tested its potential in mouse models of demyelination. Baclofen exerted a protective effect following lysolecithin-induced spinal cord demyelination, promoting OPC differentiation and the remyelination rate within the lesions. Similarly, baclofen ameliorated the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and enhanced OPC differentiation in EAE lesions. We also evaluated the consequences of GABAB1 deletion in OPCs, inducing EAE in knockout mice lacking the receptor subunit, and observed that symptom severity was reduced in these mice in the acute phase of the EAE. Single nuclei RNA sequencing analysis in these mice revealed several differentially expressed genes, including upregulation of immune genes in oligodendrocytes following GABAB1 ablation. Finally, we tested the effect of baclofen in physiological conditions during rat development myelination. No relevant differences were found following baclofen treatment in oligodendrocytes or in myelination levels, but baclofen significantly reduced the density of interneurons in the cortex of developing rats. Interestingly, earlier baclofen administration did enhance OPC differentiation in the cortex. Taken together, these results provide evidence about the relevance of GABABR in OPC differentiation and identify its agonist baclofen as a promising candidate for remyelinating therapies in multiple sclerosis.

Alcohol (OH) abuse is a worldwide public health concern and the ECS components that can be critically involved in the long-term deleterious impact of adolescent binge drinking. Nutritional supplementation with omega-3 (n-3) polyunsaturated fatty acids (PUFAs) might be an approach to treat these deficits, in part because OH decreases n-3 PUFAs having a negative effect on brain synaptic plasticity. However, despite the close relationship between OH, n-3 PUFAs and the ECS, the direct impact of n-3 PUFAs on the ECS expression and function in adult brain after binge drinking and under normal conditions remains unknown.

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo que afecta al 1-5% de las personas mayores de 60 años, con mayor incidencia en hombres. Se caracteriza por la pérdida de neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra (SN), y la acumulación patológica de alfa-sinucleína (alfa-sin) en cuerpos y neuritas de Lewy, siendo características neuropatológicas clave de esta patología. Los modelos animales empleados hasta el momento no han logrado explicar completamente los cambios observados en los enfermos de Parkinson. Es por ello, por lo que en este trabajo se analizan los cambios morfológicos derivados de la sobreexpresión de alfa-sin en un modelo rata de EP, basado en la sobreexpresión de alfa-sin mediante la inyección bilateral de un vector viral adenoasociado AAV9 en la SN, así como los efectos neuroprotectores de la cría en un entorno enriquecido (EE). Los resultados revelaron que este modelo replicó la progresión de la EP, tanto a nivel conductual como histológico, evidenciando un aumento progresivo de la sobreexpresión de alfa-sin, una disminución de células y fibras dopaminérgicas de la vía nigroestriatal, y un incremento de la presencia de agregados axonales, semejantes a los observados en las neuritas de Lewy de los pacientes con EP. Además, el EE promovió mejoras funcionales y morfológicas. Se observó una reducción de la degeneración nigroestriatal y un aumento en la expresión de factores neurotróficos. Por otro lado, el EE redujo la neuroinflamación causada por la sobreexpresión de alfa-sin. En conclusión, la cría en EE modula positivamente las alteraciones asociadas a la sobreexpresión de alfa-sin en este modelo experimental de la EP.

Alzheimer's disease (AD) remains a complex and multifaceted puzzle, with a sequence of biological events preceding the emergence of clinical symptoms. Traditional biomarkers fall short in defining this preclinical phase, highlighting the importance of exploring genetic, molecular, cellular, and demographic factors that shape AD trajectories. Recent findings suggest a potential link between amyloid-ß (Aß) ¿ a hallmark of Alzheimer's pathology ¿ and neuronal hyperactivity in early AD stages. This link may be mediated by Aß-induced alterations in glutamate uptake by astrocytes, prominent glial cells in the brain involved in AD development. Within this framework, the thesis investigates the role of astrocytes during AD onset and progression. To this end, first we create a bioinformatics pipeline to extract astrocyte-specific gene expression from RNA sequencing data across disease stages. This analysis reveals sex and regional variations in AD trajectories. We then explore the molecular pathways leading to hyperactivity by modeling the interplay between glutamate-mediated neuronal activity, Aß-dependent glutamate uptake, and activity-dependent Aß production. This intricate interaction results in various AD trajectories characterized by hyperactivity. Lastly, we integrate genetic, molecular, and cellular insights to identify potential risk factors for hyperactivity. We build a computational model of glutamate transporter dynamics based on astrocyte gene activity during AD and transporter expression in mouse experiments. This model uncovers stage-dependent modulation of transporter-related mechanisms by Aß, emphasizing the dynamic nature of molecular and cellular correlates along AD trajectories. By studying the role of astrocytes in defining AD trajectories, this thesis aims to enhance our understanding of the disease and offer insights for diagnosis and therapeutic interventions.

Las vesículas extracelulares (VEs) son elementos clave en la comunicación intercelular, incluso en el sistemanervioso. Las VEs derivadas por células gliales contribuyen a la regeneración de nervios dañados, probablementeregulando la síntesis local de proteínas. En el caso del sistema nervioso central, no hay evidencias que relacionen lasVEs gliales con la síntesis de proteínas intra-axonal. Así, en esta Tesis Doctoral, se propone que VEs liberadas porlos astrocitos en respuesta al péptido amiloide (Aß) regulan la traducción local en los axones y pueden, enconsecuencia, afectar a la supervivencia celular y la función sináptica. Por un lado, los resultados sugieren quefactores secretados en presencia de astrocitos en cultivo modulan el proteoma local de las neuritas y, en particular,regulan al alza proteínas implicadas en la traducción, como las proteínas ribosomales Rps6 y Rpl26, en condicionespatológicas. Además, se ha demostrado que las VEs liberadas por los astrocitos en respuesta al péptido Aß estimulanla síntesis localizada de proteínas en axones. Por otro lado, estas VEs astrogliales secretadas en condicionespatológicas inducen un incremento de las terminales pre- y postsinápticas así como de la complejidad de la redneuronal de tubulina. El análisis del contenido proteico de las VEs astrogliales indica que éstas contienen proteínasribosomales, incluyendo Rps6. Resultados preliminares sugieren que Rps6 es el regulador responsable de latraducción local por parte de las VEs astrogliales liberadas en respuesta al péptido amiloide. Y lo que es másinteresante, también sugieren que el efecto sobre la integridad de las sinapsis estaría mediado por dicha traducción.

Se ha analizado mediante revisión sistemática, el riesgo de desarrollar trastornos de la conducta alimentaria y dismorfia muscular en dos estudios. Tanto el primer estudio como el segundo, revisan estudios de intervención útiles para la implementación de programas de prevención y formación. Además se ha realizado, un estudio piloto de cribado de sintomatología relacionada TCA, Trastorno dismórfico y Trastornos de abuso en la población que practica de forma periódica actividad física y deporte en la CAPV y en las personas que practican deporte de alto o medio rendimiento, asi como usuarios de gimnasios culturistas y no culturista, analizando su consecuente agravamiento por la suplementación y medicación (sobre todo esteroides anabolizantes androgénicos) . Se han utilizado herramientas válidas y fiables como son: EDI-3 RF : -- inventario de trastornos de la conducta alimentaria : cuestionario de remisión, adaptado por Elosua, Alicia López-Jáuregui, Fernando Sánchez Sánchez (2010); Escala de Satisfacción con la Apariencia Muscular (MASS, Mayville, Williamson, White, Netemeyer y Drab, 2002); Instrumento de medición Escala de Actitudes de Mejora del Rendimiento (Performance Enhancement Attitude Scale [PEAS]) (Petróczi, 2002) y Cuestionario de Comportamiento de Dopaje (Petróczi, 2007). El screening de burnout se mide mediante el Ítem único de burnout en (Merino-Soto y Fernández-Arata, 2017).

Neuronal hyperexcitation is a hallmark of epileptic conditions, however, its specific effects on hippocampal neural stem cells (NSCs) and hippocampal neurogenesis (HN) in the dentate gyrus (DG) remain unfolded. We are thus interested in Dravet Syndrome (DS), a severe form of infant epilepsy characterized by the early onset (3-6 months of age) of seizures, when NSCs are at its maximum. Therefore, we hypothesize that DS early seizures could have a greater and longer-lasting impact on the neurogenic niche due to their early onset. Mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) is the most relevant form of epilepsy that courses with neuronal pathological hyperexcitation, where the hippocampus is the focus of seizures. The hippocampus, pivotal for learning, memory acquisition and emotional processing, is highly vulnerable to pathological neuronal hyperexcitation due to its intricate recurrent circuits and synaptic plasticity. Despite advances in epilepsy management, nearly 30% of epilepsy patients are drug-resistant and present hippocampal sclerosis (MTLE-HS). Human MTLE-HS (hMTLE-HS) is featured by neuronal loss in CA1 and CA4 regions, glial scar formation, hippocampal atrophy, and granule cell layer (GCL) dispersion. Our previous MTLE-HS model represents a severe advanced form of the pathology,with therapeutic and research limitations, but now we aim to develop a milder model that better mirrors hMTLE clinical progression. MTLE, alongside other epilepsies and some neurodegenerative disorders such as Traumatic Brain Injury (TBI) or Alzheimer's Disease (AD), exhibits frequent episodes of subclinical non-convulsive epileptiform activity (EA), featured by spikes and wave discharges that seem to accelerate cognitive decline by triggering DG neurogenic niche cellular alterations, not yet deeply described. However, understanding how EA affects DG integration over extended periods remains elusive, largely due to the absence of standardized pure EA models. Revealing to which extent EA participated in epilepsy development by affecting NSCs, thus inducing aberrant neurogenesis is one of our purposes. Herein, we have implemented reliable pure mice models through intrahippocampal injection of KA at 0.74mM for EA and 2.22mM for MTLE with mild sclerosis and slow progressive (spMTLE) clinical projection, which resembles the human evolution of MTLE, to investigate cellular alterations due to pathological neural hyperexcitation and how these cell changes affect hippocampal functions. The KA models and Dravet Syndrome model provide distinct insights into how different levels of pathological neural hyperexcitation affect hippocampal neurogenesis, gliosis, and microglial function. Our results show that while EA induces a controlled neurogenic response without sustained damage over time, spMTLE leads to chronic neurodegeneration, validating it as a model for human MTLE. The Dravet model shows early, severe alterations in the neurogenic niche, highlighting the importance of early therapeutic interventions to prevent or mitigate long-term cognitive deficits and preserved neurogenesis.

La esclerosis múltiple es una enfermedad neurológica, crónica, degenerativa, autoinmune. Considerada lasegunda causa más frecuente de discapacidad en el adulto joven. En España se estima que hay unos55.000 casos. Se diagnostica en lo que se considera como edad fértil de un individuo (20-40 años). Suprevalencia e incidencia es mayor en mujeres que en hombres. A tenor de estos datos, todas lascuestiones relativas a la planificación familiar en estos pacientes, son imprescindibles en el contexto delmanejo habitual de su patología, y nos obligan a estar bien informados y formados para poder asesorar yactuar con el máximo rigor.Analizando los datos de los pacientes que participan en el registro andaluz de embarazos y esclerosismúltiple, los objetivos de esta tesis doctoral se basan en estudiar los aspectos más relevantes de laplanificación familiar en hombres y mujeres que padecen la enfermedad. Nos interesa conocer laevolución de cada una de las etapas de la gestación en mujeres con esclerosis múltiple que se quedanembarazadas, la fertilidad de hombres con esclerosis múltiple, la salud de los recién nacidos de pacientescon esclerosis múltiple, en especial, si en la concepción y/o la gestación influye algún tratamientomodificador de la enfermedad, queremos conocer las preferencias sobre lactancia de las pacientes conesclerosis múltiple, y por último estudiar la repercusión que tiene el embarazo en la evolución a cortomedioplazo de la enfermedad.Las principales conclusiones que hemos obtenido son: 1) El embarazo de una mujer con esclerosismúltiple transcurre sin incidencias relevantes y las complicaciones detectadas se asemejan a lo que secomunica en la población general (incluída la tasa de abortos espontáneos). 2) No apreciamos problemasde fertilidad en los hombres con esclerosis múltiple. 3) La salud del feto/recién nacido, si algunos de susprogenitores tiene esclerosis múltiple, es buena, y hemos detectado un elevado porcentaje de bajo peso alnacer. Ninguna de las complicaciones médicas, prematuridad o bajo peso del recién nacido se hanrelacionado con el uso de un tratamiento modificador de la enfermedad en la concepción y/o gestación.Aquellos bebés que nacen cuando sus progenitores recurrieron a una técnica de reproducción asistida sítienen mayor prevalencia de prematuridad, pero este es un hallazgo que se replica en los bebés de lapoblación sana sin esclerosis múltiple que usa estas técnicas. 4) La lactancia materna se impone comopráctica entre las pacientes con esclerosis múltiple, incluso en algunos casos mientras se usa untratamiento modificador de la enfermedad. 5) La evolución de la esclerosis múltiple a corto-medio plazono se ve modificada por el embarazo ni por la lactancia, y el riesgo de empeoramiento clínico en lagestación se relaciona con una elevada actividad de la enfermedad antes de que la gestación tenga lugar.

Las enfermedades priónicas son enfermedades neurodegenerativas fatales que afectan a mamíferos ysurgen por el cambio conformacional de la proteína priónica celular (PrP) a una forma patogénica con tendencia a agregar, prion. Aunque la PrP está altamente conservada, distintas especies muestran variabilidad en su susceptibilidad a estas enfermedades, posiblemente debido a diferencias en la estructura terciaria y primaria de la proteína. En este estudio se utilizaron cientos de secuencias del genPRNP de mamíferos para construir árboles filogenéticos basados en este gen. Aunque los resultadoscoinciden en gran medida con la filogenia establecida, se observan variaciones que podrían deberse a lainfluencia de las enfermedades priónicas en la evolución del gen. Además, se evaluó la capacidad de malplegamiento de estas proteínas utilizando la PMSA, permitiendo su clasificación según la tendencia al mismo. Este estudio proporciona información detallada sobre la estabilidad e infectividad de las proteínasgeneradas. El análisis sugiere que las enfermedades priónicas no han ejercido un gran efecto selectivo en la evolución de la PrP. Los resultados ofrecen valiosos recursos para futuras investigaciones, y tienen aplicaciones potenciales en estudios estructurales, de patobiología y desarrollo de terapias.

EuskaraIkerketa honek ahotsaren ezaugarri akustikoak nerabeen arrisku suizidaren adierazle izan daitezkeela aztertzen du.Diziplina anitzeko ikuspegi bat erabiltzen du, ahots-analisiak eta osasun mentaleko galdetegiak konbinatzen dituena portaera suizidekin lotutako patroiak detektatzeko.Azterlanak funtsezko maiztasuna, hezitzaileak, intentsitatea eta ahots-aldakortasuna (Jitter) bezalako parametroen garrantzia nabarmentzen du, ebaluaziorako eta ondorengo jarraipen klinikorako eredu berritzaile bat eraikitzeko informazio garrantzitsua emanez. Arrisku-egoeran dauden gazteen detekzio goiztiarra eta esku-hartzea hobetu nahi dira, osasun mentalerako tresna erabilgarria eskainiz.CastellanoLa presente investigación explora cómo las características acústicas de la voz pueden servir como indicadores del riesgo suicida en adolescentes.Utiliza un enfoque multidisciplinar que combina análisis de voz y cuestionarios de salud mental para detectar patrones asociados con comportamientos suicidas. El estudio destaca la relevancia de parámetros como la frecuencia fundamental, los formantes, la intensidad y la variabilidad vocal (Jitter), arrojando información relevante para la construcción de un modelo innovador de evaluación y posterior seguimiento clínico. Se pretende mejorar la detección temprana y la intervención en jóvenes en situación de riesgo, aportando una herramienta útil para la salud mentalInglés This study investigates how acoustic characteristics of the voice can serve as indicators of suicide risk in adolescents.It uses a multidisciplinary approach combining voice analysis and mental health questionnaires to identify patterns associated with suicidal behaviour. The study will highlight the relevance of parameters such as fundamental frequency, formants, intensity and vocal variability (jitter), providing relevant information for the construction of an innovative assessment model and subsequent clinical follow-up. The aim is to improve early identification and intervention in young people at risk, providing a useful tool for mental health.

La esquizofrenia es una enfermedad crónica e incapacitante, con enorme carga humana, social, y económica a nivel mundial. En las últimas décadas, los abordajes preventivos dirigidos a evitar, retrasar, o minimizar las consecuencias de los trastornos psicóticos, están adquiriendo mayor relevancia. La presente tesis por compendio de publicaciones se fundamenta en el trabajo que la doctoranda ha realizado en los últimos años en este marco de trabajo. Se compone de tres artículos, que abordan la prevención de los trastornos psicóticos desde diferentes niveles y perspectivas. El primer artículo, Prolactin and morning cortisol concentrations in antipsychotic naïve first episode psychosis: A systematic review and meta-analysis, es una revisión sistemática y meta-análisis de alteraciones endocrinas en pacientes con un primer episodio psicótico, previo a la introducción de tratamiento psicótico, y que podrían constituir biomarcadores diagnósticos y/o pronósticos. El segundo artículo, Sexually transmitted infections, sexual life, and risk behaviours of people living with schizophrenia: A systematic review and meta-analysis, pretende aportar una perspectiva más clínica de la esquizofrenia, abordando el patrón de conducta sexual y la existencia de enfermedades de transmisión sexual comórbidas, haciendo inciso en la necesidad El tercer artículo, Number and nature of psychiatric emergency department visits in a tertiary hospital before, during, and after coronavirus pandemic, es un estudio observacional y retrospectivo de la evolución del número y la naturaleza de las consultas en el Servicio de Urgencias de un hospital de tercer nivel antes, durante, y tras la pandemia por SARS-CoV-2, con especial énfasis en los trastornos psicóticos. En conjunto, y junto con otros trabajos relevantes para el compendio en los que la doctoranda figura como autora y que se incluyen como anexos, conforman una visión transversal de los cuatro niveles de prevención en psicosis. En el apartado de Discusión, se discuten las aportaciones de la doctoranda en cada nivel de prevención, y se efectúan propuestas concretas para cada uno de ellos.