SERVICIO GENERAL DE GENÓMICA -UNIDAD DE EXPRESIÓN GÉNICA

1. Para la solicitud de servicios de la Unidad de Expresión Génica, en primer lugar se  debe contactar con el personal técnico de la Unidad para informar del tipo de servicio a solicitar y del número y tipo de muestras a analizar.
2. En el caso de usuarios externos, debe enviarse firmado la aceptación del presupuesto, previo a la solicitud del servicio. En el caso de usuarios internos (UPV/EHU) sólo se requiere la firma de aceptación del presupuesto para los servicios de extracción de RNA, microarrays y Q-PCR. Deben enviarse los datos de facturación para la aceptación de la realización del servicio.
3. Una vez confirmada la aceptación del servicio por parte del técnico/a de la Unidad de Expresión Génica, el usuario autorizado realiza la petición del servicio cumplimentando el formulario de solicitud de servicio correspondiente que entregará junto con las muestras a analizar. Las muestras deben entregarse en tubos eppendorf individuales y debidamente etiquetadas con el nombre de la muestra, acorde con el formulario de solicitud entregado. En el caso de muestras de RNA o tejido no estabilizado con RNAlater, es esencial enviarlas congeladas en nieve carbónica. Para más información sobre el envío de muestras específico para cada análisis visite el apartado Requisitos de las muestras y Servicios Ofertados. El personal técnico informará al usuario via email de la recepción de las muestras enviadas por mensajería.
4. Para la solicitud de servicios de microarrays de aCGH, ChIP-chip/metilación, microRNAs o Exon Arrays pónganse en contacto con el personal técnico de la Unidad.
5. Una vez finalizado el experimento, la Unidad de Expresión Génica informará al usuario de la finalización de éste, y se le enviarán los resultados via email, o en un CD/DVD por correo normal. El período para la entrega de los resultados depende del tipo de análisis solicitado y del volumen de muestras, y puede variar entre 24-48 h (2100 Bioanalyzer), 72 h- 3 semanas (PCR a tiempo real) a 4-6 semanas (Servicio de microarrays). Para más información visite el apartado correspondiente al tipo de servicio solicitado.
6. En el caso de modificación del presupuesto inicial, una vez entregados los resultados, la Unidad enviará al usuario a título orientativo un presupuesto final donde se especifica el tipo de servicio realizado, precio por unidad, unidades realizadas, coste total del servicio y los datos de facturación. SGIker facturará al grupo de investigación el precio acordado. En el caso del análisis de calidad de RNA con 2100 Bioanalyzer, se facturará directamente.
7. Las muestras y primers enviados por el usuario se guardarán por un período máximo de 2 meses una vez finalizado el servicio y entregados los resultados. Antes de proceder a su eliminación, el/la técnico/a se pondrá en contacto con el/la usuario/a, para confirmar su eliminación.

Recomendaciones para el envío de muestras

Las muestras deben enviarse junto con el formulario de solicitud de servicio debidamente cumplimentado. En el caso de proyectos de microarrays es importante adjuntar la mayor información posible sobre el proyecto.
Las muestras deben ir en tubos de 1,5 ml correctamente identificados con el nombre de muestra que se ha indicado en el formulario de solicitud, y disueltas en agua libre de RNasas o tratada con DEPC. Las muestras de RNA deben enviarse congeladas en nieve carbónica o hielo seco. Respecto al cDNA también se recomienda enviarlo congelado.

Cantidades requeridas

• 2100 Bioanalyzer:

Se requiere el envío de 2 ul a una concentración de 25-500 ng/ul para RNA total y  25-250 ng/ ul de mRNA en el caso de RNA 6000 Nano Chips.

• PCR a tiempo Real:

Se migra 1 ul de cDNA por reacción, y las muestras se migran por triplicado. Enviar suficiente muestra para el total de reacciones: 3 x nº genes a analizar. El cDNA debe tener una concentración de 10-100 ng/ ul (aproximadamente, guiándonos por la concentración de RNA). En el caso de Sybr Green es necesario realizar una curva estándar con 5 diluciones de una muestra patrón, preferiblemente del mismo tejido y tipo de extracción que las muestras a analizar,  y debe estar a una concentración superior a 50 ng/ ul.
El RNA empleado para la síntesis del cDNA debe tener una relación A260/280 entre 1.8-2.1.
SE RECOMIENDA EL ANÁLISIS DE CALIDAD E INTEGRIDAD DEL RNA CON  2100 BIOANALYZER O SISTEMA SIMILAR. RIN mínimo recomendado: 7.
En el caso de SYBR Green y cuando el amplicón no esté diseñado en exones diferentes (genes de un único exon), se recomienda el tratamiento con DNasa de la muestra y el envío de una muestra de RT minus, -reacción de cDNA pero sin añadir el enzima RT-, para comprobar si hay contaminación de DNA genómico y si daría lugar a un amplicon inespecífico.

• Servicio de microarrays.

       -Expresión Génica:
Para formatos de 4x y 8x: 200 ng  de RNA total disuelto en agua ultrapura libre de RNasas, a una concentración mínima de 50 ng/ul
Para formatos de 2x y 1x: 400 ng de RNA total disuelto en agua ultrapura libre de RNasas, a una concentración mínima de 100 ng/ul
Enviar las muestras correctamente identificadas en tubos eppendorf 1.5ml, congeladas con hielo seco.
Requerimientos mínimos de calidad: A260/280 ≥ 1,8; RIN≥ 7.

• miRNAs

400 ng de RNA total (no purificado en columna) a una concentración mínima de 100 ng/ul.

• CGH/CNV

Para formatos de 8x: 1 ug  de DNA  disuelto en agua ultrapura a una concentración mínima de 100 ng/ul
Para formatos de 4x, 2x, y 1x,: 2 ug  de DNA  disuelto en agua ultrapura, a una concentración mínima de 100 ng/ul
Todas las muestras DEBEN migrarse en un gel de agarosa para comprobar la integridad/degradación del DNA y adjuntar una imagen del gen junto con las muestras.
Requerimientos mínimos de calidad: A260/280 ≥ 1,7; A260/230 ≥ 1,5
NOTA: En el caso de no cumplir dichos requisitos consultar con el/la técnico/a de la Unidad

Métodos de extracción de RNA o DNA y síntesis de cDNA recomendados en el servicio

Extracción de RNA

• Para el análisis con microarrays:

       -A partir de tejido se recomienda una combinación de extracción orgánica combinada con una purificación en columna, como el sistema RiboPure kit de AMBION.
       -Para células o cultivos celulares, la extracción orgánica con TRI Reagent (AMBION) o Trizol Reagent (Invitrogen) o la purificación en columna con RNAqueous kit (AMBION) es suficiente.

• Para PCR a tiempo Real

       -A partir de tejido: extracción orgánica con TRI Reagent (AMBION) o Trizol Reagent (Invitrogen)
       -Para células o cultivos celulares el sistema de purificación en columna RNAqueous kit de AMBION, o extracción orgánica con TRI Reagent (AMBION) o Trizol Reagent (Invitrogen).

• Para la extracción de RNA a partir de pequeñas cantidades de muestras, por ejemplo obtenidas a partir de microdisección por láser se recomiendan dos métodos ya validados para PCR a tiempo real: Absolutely RNA Nanoprep kit de Stratagene; y RNAqueous Mikro kit de AMBION combinado con LCM Staining kit (AMBION).
• Para la extracción de RNA para el análisis de microRNAs mediante el sistema de microarrays de miRNA, Agilent Technologies recomienda tres métodos de extracción: miRNeasy Mini kit de QIAGEN, mirVana RNA isolation kit de AMBION, Trizol Reagent de Invitrogen o TRI Reagent de AMBION. Agilent recomienda seguir las instrucciones de los fabricantes  para la extracción de RNA total.

Extracción de DNA para el sistema de microarrays de aCGH de Agilent Technologies:

• Se recomiendan métodos basados en la purificación en columnas de membrana de sílice (p.ej. QIAmp DNA blood extraction kit y QIAmp DNA mini kit de QIAGEN). Agilent Technologies recomienda el kit DNeasy Blood & Tissue kit de QIAGEN
• Para la extracción de DNA genómico a partir de muestras fijadas y emparafinadas (FFPE) consultar con el/la técnico/a de la Unidad.

Métodos para la síntesis de cDNA a partir de RNA total para el análisis de expresión génica mediante PCR a tiempo real.

• Se recomienda el uso de random primers.
• La unidad ha validado con éxito tres kits de síntesis de cDNA: High-capacity cDNA Reverse Transcription kit with RNAse Inhibitor, de Applied Biosystems;  High-capacity RNA-to-cDNA Master Mix de Applied Biosystems  y SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR, de Invitrogen.

Requisitos de Calidad de las muestras de RNA

Uno de los pasos críticos para el éxito de los análisis realizados mediante PCR a Tiempo Real y la tecnología de microarrays es la calidad de las muestras de RNA. La calidad del RNA se mide en base a tres parámetros básicos:

• Pureza: La contaminación de la muestras con impurezas orgánicas e inorgánicas (p.ej. fenol, cloroformo), y proteínas afecta de forma significativa la sensibilidad y especificad del resultado. Para determinar el grado de pureza del RNA se determina la relación de absorbancia A260/280, que debe ser ≥ 1,8.
• Integridad: La absorbancia a 260 nm y la relación A260/280 sólo nos da una indicación de la cantidad de RNA y del grado de contaminación de impurezas orgánicas e inorgánicas, pero no nos dice nada sobre el nivel de degradación de RNA. Existen dos métodos para determinar el grado de degradación del RNA:

       -Relación entre las bandas ribosomales 28S y 18S que se observan en un gel de agarosa como bandas discretas y cuya relación 28S/18S en un RNA íntegro es cercano a dos. Se recomienda una relación 28S/18S ≥ 1,2.
       -RIN: RNA Integrity Number, es un número que aplica el algoritmo del software del Bioanalizador 2100 Bioanalyzer de Agilent Technologies y que es un indicador del grado de degradación de la muestra de RNA. Un RNA intacto tiene un RIN 9-10, mientras que un RNA degradado tendría un RIN <6. Para las aplicaciones de PCR a tiempo Real y microarrays se recomienda un RIN mínimo de 7, aunque depende del tipo de muestra.

• Contaminación de DNA genómico: Las técnicas de análisis de expresión génica mediante PCR a tiempo real o microarrays son técnicas extremadamente sensibles a la contaminación de DNA genómico de la muestra de RNA. La contaminación de DNA puede afectar de forma significativa a la sensibilidad y especificidad del resultado de expresión génica. El mejor método para evitar la contaminación de DNA genómico es el utilizar un método de extracción que combine al extracción orgánica en fenol (Trizol Reagent) y la posterior purificación en columna. Existen kits de purificación en columna que incluyen un pretratamiento en columna con DNasa y posterior elución del RNA. En aquellos casos en los que la muestra contenta un grado de contaminación inaceptable para la aplicación de microarrays o PCR a tiempo Real con SYBR Green (especialmente importante) debe tratarse la muestra con DNasa (QIAGEN o AMBION) y repurificar en columna tras el tratamiento. Es muy importante eliminar totalmente la DNasa ya que inactiva la reacción de retrotranscripción requerida en la síntesis de cDNA o cRNA.

       -DNA-free: a new method to remove DNA, AMBION
       -Avoiding DNA contamination in RT-PCR
       -RNase free DNase set, QIAGEN
       -RQ1 RNase-free DNase, Promega

Es esencial que las todas las muestras del análisis tengan grados de pureza (A260/280) e integridad (28S/18S y/o número RIN) comparables.

Para más información sobre la calidad del RNA y cómo analizarla lea las siguientes notas de AMBION:

• Assessing RNA quality: The Good, The Bad and the Ugly
• Is your RNA intact? Methods to check RNA integrity: AMBION TechNote 8(3)
• Assessing RNA quality: AMBION TechNote 11(1)
• Determinants of RNA integrity and Purity: AMBION TechNote 11(2)

Recomendaciones básicas para el manejo de RNA

El RNA es un material extremadamente sensible y deben tomarse las máximas precauciones para evitar la contaminación con ribonucleasas (RNasas) y su degradación. Las RNasas son unas enzimas muy estables y activas que hidrolizan el RNA y no requieren de cofactores para su función. Las RNasas son muy difíciles de inactivar, soportan el autoclavado y son insensibles a los métodos estándar para la inactivación de proteínas. Es importante trabajar en un ambiente libre de RNasas, y debe tratarse el material para su eliminación. Las siguientes recomendaciones ayudan a prevenir la contaminación de RNasas:

• Utilizar guantes durante todo el proceso de manejo de muestras, material fungible y de vidrio, y extracción de RNA. Las RNasas están presentes en grandes cantidades en la piel y es la mayor vía de contaminación de RNasas. Durante la extracción intentar trabajar lo más rápido posible para minimizar la exposición con RNasas y evitar la degradación del RNA.
• Opcional: Tratar superficies, extremos de las pipetas y gradillas con RNaseZap (AMBION) u otra solución descontaminante de RNasas. Utilizar pipetas específicas para el manejo de RNA.
• Mantener la muestra de RNA siempre en hielo o bloque frío, al menos que esté disuelta en un disolvente orgánico.
• Utilizar material plástico desechable (tubos, puntas de pipetas) estéril y certificado libre de RNasas.
• El material de vidrio autoclavado debe incubarse en un horno a 240ºC toda la noche. Los tapones de plástico, y otro tipo de material de plástico no desechable como cubetas de electroforesis, probetas, vasos de precipitados, debe lavarse con 0.1M NaOH, 1mM EDTA durante 5 minutos, y enjuagarse con agua MilliQ libre de RNasa. Alternativamente, material de plástico resistente al cloroformo, puede enjuagarse con cloroformo.
• El agua y las soluciones (excepto aquellas que contengan Tris-base) deben tratarse con DEPC* (dietil pirocarbonato) 0,1 % (v/v en agua destilada). Durante la preparación de la solución de 0,1 % DEPC mezclar vigorosamente la solución durante 1 minuto, incubar a temperatura ambiente durante toda la noche en la campana de extracción, y autoclavar la solución antes de su uso para inactivar el DEPC. Si la solución contiene Tris-base, preparar la solución con agua-DEPC autoclavaza.

* Precaución: El DEPC es tóxico y posible carcinógeno. Utilizar guantes y realizar todo el proceso en una campana de extracción hasta su inactivación por autoclavado.

• Se recomienda resuspender el RNA en agua ultrapura tratada con DEPC o libre de RNasas.

Recomendaciones para la extracción del RNA

Se recomienda el uso de muestras frescas para la obtención del RNA. Para la extracción de RNA a partir de tejidos, existen 3 opciones:

• Homogenizar inmediatamente el tejido en la solución de lisis.
• Si no es posible la homogenización inmediata, hay que estabilizar el tejido inmediatamente tras su aislamiento. Existen dos métodos para su estabilización:

       -Congelar el tejido en nitrógeno líquido inmediatamente después de su obtención. El tejido así congelado puede mantenerse a -80ºC hasta la extracción del RNA. Para la extracción, trocear y pesar el tejido sin descongelar, mantenerlo en hielo seco hasta su homogenización en la solución de lisis.  Para facilitar la extracción, se recomienda aislar pequeños trozos de tejido (<100 mg).
       -Otra solución para acumular tejido hasta el momento de la extracción, es utilizar una solución estabilizadora de RNA como el RNAlater de AMBION. Seguir las instrucciones del fabricante. La estabilización en RNAlater permite trabajar a Temperatura ambiente (por ejemplo, para el envío del tejido por servicio de mensajería) sin el riesgo de la degradación del RNA. Las muestras de tejido deben tener un grosor < 0.5 cm. Se recomienda aislar varias muestras pequeñas (grosor < 0.5 cm), en lugar de una grande, para la correcta penetración del RNAlater en el tejido; si la muestra es demasiado gruesa, el RNAlater no penetra hasta el interior y no se obtiene una adecuada estabilización, con la consecuente degradación irrecuperable del RNA previa a su extracción.

Para el análisis de expresión génica es imprescindible el procesamiento de las muestras control o referencia y experimental en paralelo y siguiendo exactamente el mismo procedimiento.

Las técnicas de microarrays y de PCR a tiempo real son técnicas extremadamente sensibles que requieren de muestras de gran calidad e integridad, libres de impurezas y DNA genómico.

Para el acceso a la Unidad de Expresión Génica se deben cumplir los requisitos establecidos en el Protocolo de acceso a los SGIker y de uso de los servicios disponibles.