Tesis defendidas

Tesi hau Urdaibaiko Biosfera Erreserbako sistema sozial-ekologikoaren ekosistemen zerbitzuen ebaluazio eta balorazioan zentratzen da, beti ere paisaiaren antolamendu eta kudeaketa iraunkorrerako erabaki-hartze prozesuan lagungarri izateko xedearekin. Horretarako, ingurumen eta informazio sozioekonomiko eta kulturala bildu genuen, eta interesdunen eginkizun aktiboa suspertu ere inkesten bitartez. Alde batetik, biosfera erreserbaren izendapenak iraunkortasunerako helburuak bete eta bertoko biztanleriaren bizi kalitatea hobetzen lagundu duen ala ez aztertu genuen. Bestetik, ekosistemen zerbitzuak iraunkortasunerako erabakiak hartzeko paradigma berri gisa kontsideratuak izanik, hauen balorazioan sakondu genuen. Lehenik eta behin, azken 44 urteotan Urdaibaiko Biosfera Erreserban gertatutako lurzoru erabileren aldaketa nagusiak ikertu genituen eta hauen inpaktu ekonomikoa estimatu genuen literaturan oinarritutako balioak erabiliz. Gero, ekosistemen zerbitzuen dimentsio biofisikoa eta monetarioa lotzen saiatu ginen. Alabaina, gure ikerketa-arean ezaugarri sozioekonomiko eta kulturalak oso ezberdinak izango zirelakoan, eta ezagutza hutsune hori betetzeko, hautaketa-esperimentu bat burutu genuen tokiko biztanleriaren lehentasunak eta kudeaketa alternatiba desberdinekin erlazionaturiko ekosistemen zerbitzuekiko euren ordaintzeko borondatea aztertzearren. Azkenik, ekosistemen zerbitzuen multidimentsionalitatea ziurtzat hartuta, ekosistemen zerbitzuen osagai ezberdinen artean (eskaintza, eskaria eta interesa) desadostasunak edo desberdintasunak aztertzeko metodologia bat proposatu genuen sozioekonomikoki eta ingurumenaren aldetik antzekoak diren Urdaibaiko Biosfera Erreserbako unitate desberdinetan. Orokorrean esan genezake, lortutako informazioa tokiko mailan erabaki adostuak hartzeko eta gatazka potentzialak konpontzeko eta iraunkortasunerako kudeaketa errazteko baliagarria izan daitekeela.

Anthocyanins and flavanols play an important role in the quality of wine contributing to sensory aspects such as colour, astringency or bitterness and they can also help in the differentiation between grape varieties and growing conditions of the grapes. In this work, 18 new anthocyanin derivatives, which are formed by direct condensation of anthocyanin with two units of flavanols, have been identified by HPLC-DAD-MS/MS. Moreover, the detection conditions for 22 compounds, some of them identified in previous works, have also been optimized. On one hand, the formations and evolutions of different anthocyanin derivatives and tannins during different stages of winemaking have been studied. It can be seen that the formation of anthocyanin derivatives starts quickly as anthocyanins are being extracted from grape. In contrast, the extraction and formation of tannins occurs slower than anthocyanins and anthocyanin derivatives. On the other hand, 196 samples were analyzed by HPLC-DAD-MS/MS in order to compare wines from different region (Rioja and Bordeaux). Some significant differences between red wines have been found, as consequence of different grape varieties used in each region. However, major differences are due to the different wine styles within each region, mainly related with the extension of time ageing. In addition, the information obtained in this work in relation to the composition of anthocyanins, anthocyanin derivatives and tannins of Rioja and Bordeaux wines has allowed us to carry out a PCA study for the differentiation of wines from different regions or styles.

El nitrógeno es un nutriente esencial para las plantas, y decisivo para la productividad de los cultivos. La fertilización intensiva, principalmente en forma nítrica, tiene un impacto negativo en el medio ambiente, debido a las pérdida de nitrato por lixiviación y a la emisión de gases de efecto invernadero. La combinación de fertilizantes de base amoniacal junto con inhibidores de la nitrificación se han revelado en las últimas décadas como una estrategia prometedora para minimizar el impacto de la fertilización nitrogenada. Sin embargo, las plantas muestran preferencia por al fuente nítrica, de tal manera que el amonio en altas dosis resulta nocivo para la mayoría de las plantas. Este trabajo se ha realizado en Brachypodium distachyon, especie considerada como planta modelo para el estudio de cereales, con el objetivo de validad la idoneidad de esta especie como modelo para el estudio de la nutrición amoniacal, y así poder profundizar en sus mecanismos de respuesta. Se ha utilizado la línea de referencia Bb21. La principal estrategia de Brachypodium para adaptarse a la nutrición amoniacal consisten en una adaptación metabólica que implica al metabolismo del carbono y del N, destacando el papel del ciclo de Krebs en la raíz. La raíz actúa así como primera barrera fisiológica, que acumula amonio y aminoácidos, limitando el transporte del amonio hacia los tejidos fotosintéticos. Los estudios proteómicos llevados cabo en la raíz revelan, además, que otros procesos participarían en la respuesta de la raíz a la nutrición amoniacal, tales como la biogénesis de la pared celular y el balance redox de la célula. Interesantemente, un gran número de proteínas relacionadas con el metabolismo del Fe, se vieron reguladas. Los datos en global señalan que la nutrición amoniacal favorece la síntesis de compuestos quelantes, como los fitosideróforos de la familia de los ácidos mugénicos, para favorece la toma de metales, tales con el hierro y el zinc. Se revela que existe una interacción en la toma de micronutrientes claves para la calidad de los cultivos con la fuente amoniacal. La adecuación de B. distachyon como especie modelo para el estudio de los mecanismos de respuesta la nutrición amoniacal, así como disponibilidad de múltiples accesiones naturales, recientemente secuenciadas y anotadas hacen que esta especies sea idónea para la búsqueda de los genes causales que subyacen a la variabilidad natural. El proyecto se completa con un análisis de genoma completo llevado a cabo utilizando una veintena de marcadores bioquímicos y metabólicos mediante un modelo mixto multilocus (MLMM) en un panel de 52 accesiones naturales, lo que ha revelado un número importante de SNPs (polimorfismo de nucleótido único), en cuya proximidad genómica pueden localizarse genes causales de la tolerancia al amonio en B. distachyon.

La sequía es, a escala mundial, uno de los principales factores limitantes del crecimiento y desarrollo de las plantas, que afecta a la producción e incluso a la calidad de los cultivos. Teniendo en cuenta que el agua es un recurso cada vez más escaso y que se espera que la frecuencia, duración y severidad de las sequías aumente en los próximos años debido al cambio climático, existe una necesidad urgente de incrementar el rendimiento de los cultivos en condiciones de sequía a fin de satisfacer las demandas nutricionales de la creciente población mundial. Esta producción debe realizarse de forma sostenible y respetuosa con el medio ambiente para lograr un uso eficiente de los recursos naturales, como el suelo y el agua. Debido a las propiedades derivadas de la fijación biológica de nitrógeno, las leguminosas son uno de los cultivos agrícolas más importantes tanto del presente como del pasado, especialmente por su interés en la alimentación humana y animal. La alubia (Phaseolus vulgaris L.) es la leguminosa de grano de consumo humano de mayor producción a nivel mundial. La inoculación de P. vulgaris, con cepas de rizobio nativas y eficientes, adaptadas a sequía, podría jugar un papel clave en sostenibilidad agrícola y económica de su cultivo, para afrontar futuros escenarios de cambio climático. El objetivo general de esta tesis fue la búsqueda y selección de la asociación simbiótica Phaseolus vulgaris-rizobio con mayor tolerancia a la sequía, para incrementar la producción de alubia bajo estrés hídrico. Para ello, se realizó un ensayo de campo y dos experimentos en condiciones controladas, a fin de evaluar el efecto de la sequía y la inoculación de cepas en doce genotipos alubia. En el ensayo de campo, los genotipos de alubia se cultivaron en campos de manejo ecológico y convencional, con la microbiota natural del suelo, tanto en condiciones de regadío como de secano. Las bacterias presentes en los nódulos de los genotipos identificados como más productivos en condiciones de sequía fueron aisladas e identificadas (mediante BOX+ REP-PCR y secuenciación del rDNA 16S). Además, también se aislaron e identificaron las bacterias presentes en nódulos de plantas cultivadas en suelos de alta salinidad. Posteriormente, por un lado, se seleccionaron los macrosimbiontes (genotipos de alubia en ausencia de inóculo) con mayor tolerancia a la sequía en un ensayo de invernadero, identificando los rasgos morfofuncionales de tolerancia al estrés. Mientras que, por otro lado, se evaluaron y seleccionaron los microsimbiontes (entre 9 de las bacterias aisladas en condiciones de sequía y de salinidad y la cepa de referencia CIAT899) con el mayor potencial en sequía, en un experimento de cámara de crecimiento. Nuestros resultados indican que, en condiciones de secano en el campo, la nodulación, la diversidad genética de las bacterias aisladas y la producción de grano se vieron reducidas. Sin embargo, los genotipos RL, N, AA y NB fueron los más productivos en condiciones de secano. El suelo ecológico sometido a sequía presentó un mayor contenido de células viables de rizobio, mayor nodulación de las plantas y mayor número de cepas aisladas, con mayor diversidad genética tanto a nivel de cepa como de especie, respecto al suelo convencional. Según nuestros datos, en ausencia de inóculo, MU, PA y VO fueron los genotipos que pueden ser considerados tolerantes a la sequía, especialmente VO. De las cepas aisladas en los suelos agrícolas y salinos, se encontró que tres de ellas fueron eficientes en condiciones de sequía, siendo una cepa aislada de una de las plantas más productivas en condiciones de sequía, 353 (Rhizobium gallicum) y dos cepas de Rhizobium etli aisladas de suelos salinos (A12 y A13). Éstas mostraron alta infectividad (alto peso fresco de nódulos) y efectividad (alta biomasa aérea) y fueron las más eficientes, superando incluso la cepa de referencia CIAT899, tolerante a la sequía, y el tratamiento de fertilización con nitrógeno, en condiciones de sequía. Por tanto, es esperable una mejora de los efectos negativos de la sequía sobre la producción de alubia, mediante la inoculación de estas cepas.

La contaminación del suelo es un problema ampliamente extendido que afecta negativamente a la salud del ecosistema edáfico y, por ende, al suministro de servicios ecosistémicos. La presencia simultánea de contaminantes orgánicos e inorgánicos es una situación frecuente que agrava los efectos tóxicos de la citada contaminación y dificulta la remediación de emplazamientos contaminados. En esta tesis, para recuperar la salud de suelos degradados por contaminación mixta, se ha evaluado la efectividad, de forma individual y combinada, de diferentes opciones de remediación biológica: (i) la bioestimulación mediante la aplicación de un material orgánico bioestabilizado procedente del reciclado de residuos sólidos urbanos; (ii) la fitorremediación mediante el cultivo de colza (Brassica napus); (iii) la vermirremediación mediante la inoculación de lombrices pertenecientes a la especie Eisenia fetida; y (iv) la bioaumentación mediante la inoculación de un consorcio de actinobacterias. Asimismo, se ha evaluado la eficacia de la nanorremediación a través de la aplicación de nanopartículas de hierro cero valente. Respecto a los contaminantes objeto de estudio, se ha evaluado la eficacia de las citadas técnicas para remediar un suelo contaminado con elementos traza (Zn, Cu, Cd) y gasóleo, y otro contaminado con Cr(VI) y lindano. La recuperación de la salud de suelo se midió mediante la determinación de una variedad de parámetros fisicoquímicos y biológicos con potencial indicador. Nuestros resultados apuntan a que la inertización de los elementos traza es un primer paso esencial en la recuperación con suelos con contaminación mixta. Esta inertización puede lograrse mediante la modificación de las propiedades del suelo como consecuencia de la aplicación de una enmienda orgánica (e.g., material orgánico bioestabilizado). La nanorremediación con nanopartículas de hierro cero valente, a pesar de su efectividad en la inmovilización de elementos traza como el Cr(VI), encuentra obstáculos en su aplicación como se deriva de su rápida inactivación, baja movilidad y/o toxicidad en presencia de materia orgánica. Por otra parte, el cultivo de Brassica napus, asistido por enmienda orgánica, posibilita la fitogestión de suelos con contaminación mixta, promoviendo la recuperación de la salud de suelo al tiempo que se obtienen beneficios socioeconómicos, por lo que se recomienda para los suelos con contaminación mixta. La efectividad de este enfoque puede incrementarse mediante su combinación con otras estrategias biológicas como la vermirremedación o la bioaumentación.

La presente tesis, por un lado, establece un protocolo universal para definir la tolerancia a la desecación en tejidos fotosintéticos y posteriormente se centra indagar las características ecofisiológicas que posibilitan esa estrategia empleando como objeto de estudio esporas clorofílicas de helechos. Estas esporas presentan un aparato fotosintético completamente funcional en el estado maduro. Mediante la experimentación basada en esporas clorofílicas se han podido definir algunos de los aspectos claves en la fisiología de la desecación. Así, se ha podido concluir que, en estas esporas, al igual que en diversos organismos tolerantes a la desecación, existe un gradiente de tolerancia desde aquellas incapaces de tolerar la perdida de agua (consideradas sensibles a la desecación) y aquellas que llegan a tolerar varios ciclos de perdida severa de agua. Esta mayor o menor tolerancia a la desecación se ha podido relacionar con procesos fisológicos específicos y así como con los requerimientos ecológicos de las especies. Uno de los grandes descubrimientos ha sido la observación del cambio en la composición lipídica dado en las membranas de los cloroplastos en paralelo a la pérdida de tolerancia durante la germinación. En el plazo de 72h se observó una regulación a la baja de aquellos galactolípidos encargados de la estabilidad de las membranas. Además, los galactolipidos encargados de una mayor fluidez de la membrana y de una mayor actividad fotoquímica sufrieron un considerable incremento cuando la tolerancia a la desecación se perdió. Por otra parte, la disipación térmica activada en esporas clorofílicas secas se observó por primera vez en esta tesis, relacionándose este mecanismo de fotoprotección positivamente con la tolerancia a la desecación. En tercer lugar, se constató que factores como la luz y la presencia de oxígeno son los mayores condicionantes para el mantenimiento de la viabilidad de esporas clorofílicas. Por último, se concluye que el uso de este tipo de esporas ofrece una oportunidad única para estudiar este raro fenómeno en tejidos fotosintéticos. Su carácter unicelular y simple facilita el estudio de los mecanismos fisiológicos y fisicoquímicos que permiten a una célula sobrevivir a la perdida de agua, sin que esta respuesta se vea interferida por otros tejidos más complejos.

La creciente intensificación en la explotación de los suelos a escala mundial, derivada de las necesidades y demandas de una población creciente, se traduce en una presión y un deterioro progresivos del ecosistema edáfico que compromete su sostenibilidad funcional y, por ende, la seguridad alimentaria, el bienestar y la supervivencia de nuestra sociedad. En consecuencia, se hace necesaria una transición hacia modelos de producción agrícola más sostenibles que protejan la integridad ecológica y funcionalidad del ecosistema edáfico, al tiempo que promueven la productividad y calidad de los cultivos. El presente trabajo ha evaluado los beneficios y riesgos potenciales de distintas prácticas agrícolas (i.e., incorporación de rastrojo tras la cosecha, aplicación de enmiendas orgánicas al suelo, inóculos microbianos basados en micorrizas) orientadas a la disminución del uso de agroquímicos en agricultura, estudiando tanto su potencial agronómico como sus efectos sobre la salud del suelo, estimada ésta a partir de parámetros microbianos que reflejan la biomasa, actividad y diversidad de las comunidades microbianas edáficas. Nuestros resultados indican que: (i) la incorporación del rastrojo de maíz al suelo es una práctica beneficiosa para la salud del ecosistema edáfico; (ii) los beneficios potenciales de la aplicación de enmiendas líquidas obtenidas a partir de la fermentación de residuos orgánicos dependen, entre otros factores, del tipo de suelo y la dosis específica de aporte de enmienda, la cual ha de ajustarse a los requerimientos de nitrógeno del cultivo; (iii) la aplicación de estiércol fresco al suelo agrícola aporta energía y carbono lábil para las comunidades microbianas edáficas, con el consiguiente aumento de su biomasa y actividad metabólica, e incrementa el rendimiento productivo del cultivo de lechuga; no obstante, esta aplicación conlleva un riesgo de diseminación de genes de resistencia a antibióticos a los suelos agrícolas y el medio ambiente. Por otra parte, (iv) tanto el compostaje como la fermentación anaerobia del estiércol conllevan una reducción notable en la carga de determinantes de resistencia a antibióticos; (v) la aplicación a largo plazo de lodos de depuradora urbana digeridos anaeróbicamente y deshidratados conlleva una mejora en las propiedades físico-químicas y biológicas de los suelos agrícolas, pero al mismo tiempo aumenta la abundancia de genes de resistencia a antibióticos y elementos genéticos móviles de forma correlacionada con la concentración total de cobre y zinc en suelo, lo que sugiere la existencia de mecanismos de co-evolución; (vi) algunas prácticas agrícolas propias de la agricultura orgánica (i.e., laboreo mínimo y empleo de enmiendas orgánicas) ejercen un efecto negativo sobre la abundancia y diversidad de hongos micorrícicos arbusculares. La inoculación de hongos micorrícicos arbusculares mejora el rendimiento productivo del cultivo de lechuga sin ejercer una alteración notoria en las comunidades edáficas de dichos hongos. A partir de estos estudios, se concluye que la utilización de enmiendas orgánicas tiene un gran potencial agronómico. Sin embargo, su sostenibilidad como práctica agrícola depende de la minimización de los riesgos derivados de su utilización. Finalmente, la utilización de propiedades microbianas con potencial bioindicador de la salud del suelo representa una opción idónea para la evaluación y monitorización del impacto potencial de la aplicación de enmiendas orgánicas sobre los suelos agrícolas.

El incremento de la presión alimentaria como consecuencia del aumento y desarrollo de la población ha obligado a una intensificación de la agricultura. La necesidad de aplicar fertilizantes nitrogenados para obtener mayores producciones ha generado un aumento del nitrógeno reactivo presente en el medio, desencadenando problemas ambientales como el incremento del efecto invernadero, la reducción de la biodiversidad, la acidificación de los suelos y la contaminación de las aguas subterráneas. En un escenario global de emergencia climática, en el que las políticas se están enfocando hacia medidas para reducir el impacto ambiental de la actividad humana, el incremento de la sostenibilidad de la agricultura juega un papel fundamental. El uso de inhibidores sintéticos de la nitrificación permite reducir las perdidas de nitrógeno reactivo, disminuyendo la liberación de N2O, uno de los gases que más contribuye al calentamiento global. Es necesario conocer la eficiencia de estos compuestos en conjunto con otros manejos para mejorar la sostenibilidad como son los sistemas de no laboreo, de gran interés en clima Mediterráneo, así ¿ como es imprescindible garantizar la seguridad de su aplicación para la salud del suelo. En esta tesis se analiza la eficacia del inhibidor de la nitrificación 2-(3-4-dimetil- 1H-pirazol-1-yl)-acido succínico en mezcla isomérica (DMPSA), en combinación con sistemas de no laboreo para aumentar la sostenibilidad de la agricultura. Los resultados obtenidos demuestran que la aplicación de DMPSA evita la emisión de N2O derivada de la fertilización nitrogenada en suelos no labrados, sin efectos negativos en la producción y sin causar un impacto profundo en la comunidad bacteriana. Sin embargo, su aplicación puede aumentar el riesgo de volatilización de NH3 cuando se fertiliza con urea, lo cual puede ser evitado haciendo una aplicación conjunta con el inhibidor de la ureasa triamida N-(n-butil) tiofosfórica (NBPT). Nuestros estudios indican que la aplicación del DMPSA es especialmente recomendable cuando el suelo tiene contenidos relativamente altos de agua, cobre y/o zinc, condiciones que promueven las pérdidas de N2O. En conjunto, esta tesis concluye que la aplicación del inhibidor DMPSA es una técnica útil y segura para incrementar la sostenibilidad de la agricultura mediante la mitigación del impacto ambiental derivado de la fertilización nitrogenada.

El modelo de sociedad actual y el aumento de las ciudades, esta generando un incremento de la generación de residuos sólidos municipales. Este hecho ha puesto de relieve un problema que no solo afecta la parte medioambiental, sino que también la económica y la social. Por consiguiente, su gestión se ha convertido en un reto para el cual se esta buscando soluciones efectivas e innovadoras. En este trabajo, bajo un enfoque de bioeconomía circular, se estudió la posibilidad de utilizar la fracción orgánica de residuo sólido urbano, así como el compost derivado de esta, como materias primas para la producción de poli(3-hudroxibutirato) y ácido láctico, respectivamente. Por un lado, la producción de poli(3-hidroxibutirato) se llevó a cabo mediante el cultivo, en medio líquido, de la cepa Burkholderia sacchari DSM 17165. Para ello, se empleó como medio de cultivo un hidrolizado rico en azúcares obtenido a partir de la fracción orgánica de residuo sólido urbano. La obtención del hidrolizado se realizó mediante la combinación de un pretratamiento termoquímico y una hidrólisis enzimática. El hidrolizado resultante fue adecuado para el crecimiento de la cepa, pero el ratio C/N no fue lo suficientemente alto como para que tuviera lugar la producción de polímero. No obstante, la suplementación del hidrolizado con un extra de glucosa y sales incrementó el ratio y suplió los requerimientos nutricionales del microorganismo, dando lugar a la producción de poly(3-hidroxibutirato). Así mismo, con los datos obtenidos en este primer estudio, se llevó a cabo el escalado del proceso de producción del biopolímero a escala de laboratorio (5 L). Para ello se utilizó el hidrolizado de la fracción orgánica de residuo sólido urbano como medio de cultivo inicial (fase batch) por su equilibrio nutricional y un concentrado de residuos de ciruela, rico en azúcares, como ¿feed¿ en la fase-batch. Finalmente, se evaluó la viabilidad tecno-económica del proceso mediante una simulación con el software SuperPro Desigenr ®. Los resultados obtenidos indicaron que, aunque la producción de poly(3-hidroxibutirato) es técnicamente viable, no lo es económicamente, debido principalmente al bajo rendimiento de fermentación. Por otro lado, con una metodología similar a la anterior, se diseñó una estrategia para la obtención de un concentrado de aminoácidos a partir del excedente de producción de compost generado con la fracción orgánica de residuo sólido urbano. Dicha estrategia consistió en una hidrólisis proteica utilizando una combinación.

Ammonium (NH4+) is a nitrogen source of great interest in the context of sustainable agriculture. Its application in the field together with nitrification inhibitors has been extensively proven efficient to limit detrimental N losses compared to the use of nitrate (N03). NH4+ is a common intermediate involved in numerous metabolic routes. However, high NH4 concentrations may lead to a stress situation provoking a set of symptoms collectively known as "ammonium syndrome" mainly characterized by growth retardation. Those symptoms are caused by a combination of, among others, a profound metabolic reprogramming, disruption of photosynthesis, pH deregulation and ion imbalance. Numerous studies have described the way plant copes to ammonium nutrition. However, the organ developmental stage has been generally neglected. To fill in this gap, in the first chapter we first aimed studying how the metabolism is adapted in function of the leaf position in the vertical axis of the tomato plants (Solanum lycopersicum) grown with NH4+, N03- or NH4N03 supply. To do so, we dissected leaf biomass composition and metabolism through a complete analysis of metabolites, ions and enzyme activities. The results showed that C and N metabolic adjustment in function of the nitrogen source was more intense in older leaves compared to younger ones. Importantly, we propose a trade-off between NH4+ accumulation and assimilation to preserve young leaves from ammonium stress. Besides, NH4+-fed plants exhibited a rearrangement of carbon skeletons with a higher energy cost respect to plants supplied with N03-. We explain such reallocation by the action of the biochemical pH-stat, to compensate the differential proton production that depends on the nitrogen form provided. Ammonium nutrition may limit cell expansion, suggesting that the cellular processes involved would be altered. Among others, cell growth is largely dependent of the internal pressure exerted on the cell wall by the vacuole. However, the role of the vacuole in ammonium stress has been rarely addressed. In the second chapter, we evaluated the effect of ammonium stress on leaf development with a special focus on vacuole expansion and metabolism. To carry out this aim, we monitored the leaf development from its appearance until its complete expansion in plants grown under NH4+ or NO/ as unique nitrogen source. Cytological analysis evidenced that the reduced cell expansion under ammonium nutrition was associated with smaller vacuole size. Besides, we reported an acidification of the vacuole of NH4+-fed plants compared to nitrate nutrition. Moreover, a model was built to predict the thermodynamic equilibrium of different soluble species across the tonoplast. The model was set up through an extensive reviewing of vacuolar transporters and integrated subcellular volumes, vacuolar electrochemical gradients and the formation of ionic complex in the vacuole to fit the subcellular concentration of ions, organic acids and sugars measured in the leaf. Further, predictions obtained with the model were cross validated with data from non-aqueous fractionation. Firstly, the entrance of solutes was higher in vacuoles of N03--fed leaves but was not associated with higher vacuolar osmolarity likely because of the adjustment of the vacuolar volume. In this sense, we proposed that the lack of malate in cells of ammonium-fed leaves was central in the limitation of vacuolar expansion. Secondly, we conclude that the energy cost of solute transport into the vacuole is higher under NH4+ based nutrition because of the higher electrochemical gradient generated by the proton pumps across tonoplast. This work highlights the importance of considering leaf phenological state when studying nitrogen metabolism. In addition, our integrated approach place cytosolic pH control and vacuole expansion in the center of tomato leaf adaptation to ammonium stress and pave the way for future studies in the field of ammonium nutrition.

La intensificación de la avicultura de puesta ha permitido satisfacer la demanda mundial de huevos y sus derivados desde mediados del siglo pasado hasta el presente. Se prevé que el sector siga creciendo en los próximos años a nivel mundial impulsado por el aumento poblacional. Como contrapartida, la actividad avícola intensiva genera emisiones gaseosas de N a la atmósfera, que son actualmente objeto de regulación por parte de las instituciones europeas y nacionales. Las emisiones de amoniaco (NH3) son la principal fuente de emisión de la avicultura de puesta, estando las explotaciones con más de 40.000 gallinas alojadas obligadas a reportar dichas emisiones de NH3 al Inventario Nacional de Contaminantes Atmosféricos. Para ello se utilizan factores de emisión basados en el conocimiento científico-técnico actual de la actividad, los cuales no siempre recogen la variabilidad de los diferentes sistemas de gestión de las explotaciones, ni su interacción con las condiciones climáticas locales. A nivel nacional concretamente, los factores de emisión empleados tienen una alta incertidumbre debido, en parte, a los escasos estudios de monitorización llevados a cabo para cuantificar las emisiones. Además de reportar las emisiones de NH3, las explotaciones intensivas de más de 40.000 gallinas también están obligadas a la implantación de las Mejores Técnicas Disponibles (MTD) para mitigar sus impactos al medio. En este sentido, el túnel de secado de gallinaza es una tecnología empleada para reducir las emisiones de NH3 a partir de la reducción del contenido en humedad de la gallinaza. Asimismo, la implantación de esta tecnología facilita la gestión de la gallinaza en las explotaciones debido a la reducción del volumen de gallinaza alcanzado al final del proceso de secado que facilita su aplicación agronómica. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral es contribuir al conocimiento sobre la magnitud de las pérdidas de gases nitrogenados de las explotaciones avícolas de puesta intensivas y estudiar la eficiencia de medidas de mitigación de la emisión de gases nitrogenados en las mismas a través de los siguientes ámbitos: (i) la idoneidad de diferentes técnicas directas e indirectas para la estimación de la tasa de ventilación de las naves, (ii) la evaluación de la emisión de NH3 en naves equipadas con un túnel de secado de gallinaza, (iii) el establecimiento de una estrategia de medidas intermitentes de NH3 como alternativa a las medidas en continuo, y (iv) el uso de una perspectiva holística para evaluar las pérdidas de NH3 y óxido nitroso (N2O) asociadas a diferentes manejos de la gallinaza desde su generación hasta su aplicación en campo. Los resultados obtenidos indicaron que la tasa de ventilación media anual estimada con la metodología del anemómetro de hilo caliente (método directo de referencia) fue de 5,3±2,9 m3 h-1 gallina-1 en una explotación avícola situada en clima sub-mediterráneo. La incertidumbre asociada a dicha tasa de ventilación osciló entre 5,4% y 9,6%, dependiendo de las condiciones de ventilación. El método alternativo estudiado, el cual se realizó mediante el control periódico de la velocidad de rotación de 15 ventiladores de la nave, sobreestimó el caudal medio anual en un 8,3%. La estimación de la tasa de ventilación mediante el método indirecto denominado balance de CO2 sobreestimó la tasa media anual de ventilación en un 18%. El análisis de correlación entre las 3 metodologías mostró una fuerte correlación entre el método indirecto de balance de CO2 y los dos métodos anteriores (R= 0,85). En cuanto a la emisión de NH3, la emisión anual media en el alojamiento fue de 93,8±40,9 mg NH3 dia-1 gallina-1, con una incertidumbre media asociada del 9,7%. La estimación de la tasa de ventilación contribuyó en mayor grado a la incertidumbre asociada a la emisión (82,4%) que la medida de la concentración de NH3. El balance de masas de N, metodología alternativa para la estimación de la emisión de NH3 en alojamientos, resultó ser un buen estimador ya que alcanzó una sobreestimación media anual del 5%. No obstante, el balance de masas de N perdió sensibilidad para recoger las variaciones de la emisión en periodos de tiempo cortos al utilizar datos de entradas y salidas al sistema bisemanales. La emisión media de NH3 del túnel de secado de gallinaza fue de 209,3± 95.1 mg NH3 dia-1 gallina-1. La emisión de NH3 se correlacionó significativamente con la temperatura (R=0,43) y la humedad relativa (R=0,31) exterior. La emisión de NH3 procedente del túnel de secado disminuyó acorde al aumento de materia seca de la gallinaza. Con el objeto de crear un modelo estadístico para estimar la emisión de NH3 del alojamiento, la temperatura exterior resultó ser el principal factor explicativo de la emisión (46%). Con respecto a las estrategias de muestreo intermitentes, los resultados demostraron que la frecuencia mensual puede ser considerada como válida ya que el error relativo observado fue inferior al 15% con respecto a las medidas realizadas en continuo. En relación a las emisiones de gases nitrogenados asociados a la cadena de manejo de gallinaza, diferentes técnicas de mitigación de emisiones fueron corroboradas. En la etapa de alojamiento se estableció una relación exponencial entre la emisión de NH3 y el tiempo de permanencia de la gallinaza en el interior del alojamiento (reducción del 70% de la emisión de NH3 pasando de una frecuencia de retirada de 4 días a una frecuencia diaria). Respecto al almacenamiento de las deyecciones, almacenar la gallinaza seca tras su paso por el túnel de secado mostró una reducción de las emisiones de NH3 del 91% con respecto al almacenamiento de gallinaza fresca. En la fase de aplicación de la gallinaza a campo, la emisión de N (NH3 + N2O) disminuyó significativamente (i) por la aplicación superficial de gallinaza seca sobre pradera (-79%), (ii) por la incorporación de gallinaza fresca en la pradera (-78%) y (iii) por la incorporación de gallinaza seca (-84%). Aunque la incorporación de la gallinaza fresca promovió la emisión de N2O (+83%), la emisión evitada en términos de NH3, dio lugar a una menor pérdida de N total (-75%). A partir de estos resultados se concluye que: (i) respecto a la estimación de la tasa de ventilación y emisión de NH3 en el alojamiento, es viable avanzar hacia el uso de instrumentos y estrategias que faciliten las medidas sin reducir significativamente la precisión del valor y que, (ii) la aplicación de MTD en las diferentes etapas de la cadena de manejo de la gallinaza, como la remoción frecuente, el secado y la incorporación en campo de la misma, puede suponer una mitigación entre un 20% y un 50% de perdidas gaseosas de N a la atmósfera, dependiendo de las medidas adoptadas.

La producción agrícola se ve fuertemente influenciada por el clima, y cualquier cambio en el mismo puede reducir la productividad de los cultivos y poner en riesgo la seguridad alimentaria de la creciente población mundial. Las predicciones sobre el clima plantean un continuo incremento del CO2 de la atmósfera, asociado con temperaturas más elevadas y con un aumento de la duración e intensidad de las sequías. Ello implica que la productividad de los cultivos se verá afectada por complejas interacciones ambientales entre estos factores. En términos de producción, la cebada es el cuarto cereal más importantes a nivel mundial y el segundo a nivel europeo y estatal, utilizándose tanto en la alimentación animal como humana, así como en la industria maltera. Además, la cebada presenta una gran riqueza genética heredada de su ancestro: la cebada silvestre (Hordeum spontaneum K. Koch), uno de los primeros cultivos domesticados por el ser humano, confiriéndole una alta potencialidad para adaptarse a diversas condiciones climáticas como las derivadas del cambio climático. Bajo este contexto, se ha querido estudiar la respuesta molecular, fisiológica y agronómica de una variedad de cebada maltera (cv. Henley) frente a las interacciones de la elevada temperatura, el elevado CO2 y la sequía. Para ello, se ha incidido en los dos procesos principales que regulan el crecimiento vegetal: las relaciones hídricas y el metabolismo fotosintético. Además, sabiendo que en el futuro no solo se verán intensificados los periodos de sequía, sino que también ocurrirán más frecuentemente, se ha investigado la capacidad de la cebada para recuperarse de un estrés por sequía en el periodo vegetativo, así como para desarrollar un posible mecanismo de endurecimiento al sufrir otra sequía en antesis. Bajo condiciones climáticas futuras (700 ppm CO2 y 26/20 °C día/noche), las plantas de cebada presentaron un mejor estado hídrico al final del periodo de sequía en antesis gracias a un mejor control estomático y una menor deshidratación celular, respuesta parcialmente modulada por una regulación isoforma específica de las acuaporinas. Esto permitió a las plantas que crecieron en condiciones climáticas futuras mantener en mejor estado las tasas fotosintéticas, donde nuevamente la participación de una respuesta isoforma-específica de las acuaporinas pareció jugar un papel clave. Sin embargo, este efecto positivo sobre las relaciones hídricas y el metabolismo fotosintético no fue suficiente para mantener unas tasas de producción superiores ya que la elevada temperatura impactó muy negativamente sobre el desarrollo del grano. Es más, la producción de cebada fue incluso menor bajo dichas condiciones climáticas futuras. Por otra parte, las plantas que sufrieron una sequía leve en el periodo vegetativo no fueron capaces de recuperar las tasas fotosintéticas debido a limitaciones difusionales, donde una expresión a la baja de la acuaporina foliar HvPIP2;1 pudo contribuir a ello, obteniendo como resultado final una menor producción. Sin embargo, se observó que una interacción cruzada temperatura elevada-sequía debido a los efectos de una sequía leve en el periodo vegetativo, puede conferir un mecanismo de adaptación para hacer frente al estrés por la elevada temperatura. A su vez, las plantas que previamente sufrieron una sequía leve en el periodo vegetativo y volvieron a sufrir una sequía en antesis no presentaron un estado de endurecimiento. No obstante, dependiendo del grado de estrés hídrico ocasionando por la sequía en antesis, incluso presentaron una limitación difusional, habiendo desarrollado un efecto de memoria adverso, lo cual se tradujo en una menor producción bajo condiciones climáticas futuras. Estos resultados prevén que la producción futura de la cebada pueda verse comprometida, incidiendo negativamente en la seguridad alimentaria. Pese a ello, el incremento presentado a nivel de los órganos vegetativos abre una vía para que los mejoradores puedan explotar dicho potencial, incidiendo en la capacidad de la cebada para dirigir los asimilados al desarrollo reproductivo y llenado del grano en vez de al crecimiento vegetativo. Finalmente, cabe destacar que los datos obtenidos en esta Tesis Doctoral y la discusión realizada de los mismos son relevantes ya que aportan información desconocida hasta ahora sobre los efectos que la triple interacción (elevado CO2, elevada temperatura y sequía impuesta en distintos estadios fenológicos) causa a lo largo del ciclo de vida de una especie tan importante como la cebada. Además, este estudio combina análisis a distintas escalas (molecular, fisiológica y agronómica), lo que permite relacionar distintos mecanismos fisiológicos con la producción final y así poder hacer un análisis integrado de los distintos resultados.

Debido a los efectos del cambio climático, la producción de planta forestal de alta calidad con elevada capacidad de tolerancia a diversos estreses bióticos/abióticos es de gran importancia. La embriogénesis somática es una herramienta de gran utilidad no solo para la multiplicación a gran escala de plantas élite si no también para el estudio de los mecanismos implicados en la tolerancia al estrés y su modulación. Por ese motivo, en esta tesis se han aplicado altas temperaturas durante la fase de iniciación de la embriogénesis somática de pino radiata con el fin de alterar la tolerancia a sequía de las plantas somáticas obtenidas. El estudio ha demostrado que la temperatura durante la fase inicial del proceso determina el éxito de las diferentes etapas del proceso: altas temperaturas disminuyen la eficiencia en fases tempranas, mientras que incrementan la producción de embriones somáticos. Asimismo, temperaturas elevadas provocan alteraciones en la morfología de las masas embriogénicas y de los embriones somáticos. A nivel molecular también se observaron alteraciones en el perfil hormonal de las masas embriogénicas, destacando un descenso de un gran número de citoquininas isoprenoides y varios tipos de bases aromáticas, mientras que los niveles de precursores y formas de transporte de citoquininas aromáticas aumentó de forma considerable. Del mismo modo, se observaron diferencias en el proteoma de embriones somáticos procedentes de masas embriogénicas inducidas bajos diferentes temperaturas. Estas proteínas están relacionadas con la regulación de la traducción, la síntesis de ¿heat shock proteins¿, mecanismos epigenéticos y postranscripcionales y diversas rutas metabólicas, como la síntesis de ácidos grasos, compuestos fenólicos y diversos tipos de azúcares (osmolitos y azúcares de pared celular). También se observó diferencias en el perfil de ciertos amino ácidos ramificados en dichas masas embriogénicas. La temperatura también provocó la alteración de la expresión de genes relacionados con respuesta a estrés a lo largo de las diferentes fases de la embriogénesis somática, así como un descenso del nivel de metilación global en masas embriogénicas y plantas somáticas procedentes de las temperaturas más extremas. Resultados similares fueron observados para la 5-hidroximetilcitosina, que además fue identificada por primera vez en el genoma de una planta perteneciente al genero Pinus. Finalmente, las plantas inducidas bajo altas temperaturas y largos periodos de incubación presentaron tasas de crecimiento mayores en condiciones estándares, mientras que en condiciones de sequía las plantas procedentes de altas temperaturas resultaron tener menor tolerancia al estrés.

El nitrógeno (N) es esencial para el crecimiento y desarrollo de las plantas. En los suelos el N se suele encontrar como nitrato o amonio. El nitrato tiene efectos contaminantes para el medio ambiente, por lo que el uso de fertilizantes con base de amonio e inhibidores inhibidores de la nitrificación sería una mejor opción. Pero cuando las plantas crecen con amonio como única fuente de N suelen presentar síntomas de toxicidad. En trabajos previos se ha visto que los glucosinolatos (GSL) protegen a las plantas de estreses abióticos . Como objetivo se quiso comprender mejor el vínculo entre el estrés amoniacal y la síntesis de GSL. Para ello se utilizaron mutantes de Arabidopsis thaliana afectados en algún punto de la ruta de síntesis de los GSL. Demostramos que el doble mutante de los factores de trascripción MYB28 y MYB29 (myb28myb29) que carecen de GSL alifático es hipersensible a la nutrición amoniacal. Posteriormente mediante un análisis transcriptómico se observó una inducción de los genes del Fe en myb28myb29 bajo nutrición amoniacal. Resultados preliminares sugieren una función de MYB28 y MYB29 en la regulación a la respuesta de la deficiencia de Fe en Arabidopsis. Estudios futuros serán claves para descifrar el vínculo entre la señalización por amonio y la regulación de MYB28 y MYB29 y para entender con mayor profundidad la interacción en la nutrición amoniacal y la homeostasis del Fe.

Un suelo sano se define como aquel sistema que tiene resiliencia al estrés, gran diversidad biológica, y complejos niveles de ciclos internos de nutrientes. Un manejo responsable es importante para todos los sistemas agroforestales, ya que se ha demostrado que estos sistemas son especialmente sensibles a la degradación y que un mantenimiento pobre causa erosión, pérdida de materia orgánica, contaminación, compactación y excesiva salinidad. La adición de fertilizantes con alto contenido en nitrógeno y fosfato provee a las plantas de nutrientes rápidamente asimilables, incrementando la producción, pero en muchas ocasiones dañándolo a largo plazo. Por el contrario, la filosofía de la fertilización orgánica se centra precisamente en prácticas basadas en los ciclos ecológicos, cuya finalidad es frenar el impacto ambiental de la agricultura intensiva, proporcionando una sostenibilidad del sistema a la largo plazo y reduciendo al mínimo el uso de recursos no renovables. Nuestro trabajo demuestra que el uso de té de compost como biofertilizante mejora el estado fisiológico de la planta, estimula su crecimiento e incrementa su producción; además, favorece su sistema inmune, fortaleciéndola frente a patógenos. Es de destacar, que su aplicación en el suelo no sólo no altera los parámetros físico-químicos, ni la diversidad microbiana con respecto a un suelo sin fertilizar, sino que además induce sinergias que favorecen al sistema suelo-planta.

La actividad humana y más concretamente, la industria, la agricultura, el consumo de combustibles fósiles, la deforestación, la quema de restos vegetales y la ganadería han provocado un rápido aumento de gases de efecto invernadero (GEI) en el último siglo. El Panel intergubernamental para el cambio climático (IPCC) está impulsando estrategias centradas en la reducción de estos GEI, así como promoviendo el empleo de nuevas variedades (de los principales cultivos) que mejor se puedan adaptar a las futuras condiciones atmosféricas. En ese trabajo se han abordado ambas estrategias mediante diferentes aproximaciones: a) empleo de inhibidores de la nitrificación asociados a fertilizantes de base amoniacal para reducir las emisiones de N2O derivadas de la fertilización y b) identificar el impacto del nitrógeno en las relaciones fuente-sumidero de C y en la capacidad de adaptación de variedades de cereales al incremento de CO2. Los resultados obtenidos permiten confirmar que el uso de los inhibidores analizados (DMPP y DMPSA) es una estrategia efectiva para reducir la emisión de N2O debido a la inhibición de las bacterias nitrificantes. Además, se pudo describir cómo estos compuestos estimulan una completa desnitrificación, mitigando la emisión de N2O por medio de una mayor reducción a N2. Por otro lado, se ha estudiado la respuesta de trigo frente a diferentes fuentes de nitrógeno (nitrato, amonio y nitrato amónico) en condiciones de CO2 ambiental (400 ppm) y elevado (700 ppm). Bajo condiciones de elevado CO2, la fertilización mixta o amoniacal permitió un mejor ajuste de carbohidratos foliares, al contrario que la fertilización nítrica. Por último, la importancia del desarrollo de sumideros de C en condiciones de elevado CO2 y el ajuste de la relación fuente-sumidero de C en hoja se estudió en plantas de cebada con diferente capacidad de almacenar compuestos carbonados y nitrogenados en el pedúnculo. Los resultados descritos confirman la necesidad identificar variedades con mayor capacidad de sumidero de C para así permitir un mayor ajuste del C foliar con la consiguiente mejora en la actividad fotosintética bajo condiciones de elevado CO2.

A pesar de que el amonio es una fuente de nitrógeno más respetuosa cuando es suministrada junto con inhibidores de la nitrificación con el medio ambiente que el nitrato, la gran mayoría de las plantas sufren estrés amoniacal en presencia de concentraciones elevadas de esta fuente de nitrógeno. Pese a ello, las plantas muestran diferentes rangos de estrés o tolerancia a este estrés. La presente tesis está basada en un estudio de la variabilidad natural de la planta modelo Arabidopsis thaliana ante el estrés amoniacal, en un estudio de asociación de genoma completo y además profundiza en los cambios que realiza la planta a nivel metabólico y genético para adaptarse a diferentes fuentes de nitrógeno. Los resultados obtenidos muestran lo siguiente: 1. Arabidopsis thaliana es una especia que muestrea gran variabilidad en la tolerancia al amonio. 2. El estudio de asociación de genoma completo señala una región del cromosoma 4 en la que se han identificado los genes CRK como importantes en el estres amoniacal. 3. El control del pH del medio nutricional puede mitigar los efectos adversos causados por el amonio.

La costa pacífica de Nicaragua se caracteriza por una cordillera de volcanes y un clima tropical seco con alta irradiancia solar y temperaturas elevadas durante todo el año, con una estación seca desde noviembre hasta abril. Estas características hacen posible la existencia de dos formaciones vegetales únicas y de gran importancia tanto biológica, ecológica como social: i) el bosque seco y ii) el manglar. Ambos ecosistemas poseen especies que han desarrollados mecanismos morfológicos y fisiológicos para adaptarse a las condiciones ambientales hostiles. Es por ello que el objetivo principal de la presente tesis doctoral fue evaluar los mecanismos fotoprotectores de las especies más características del bosque seco y del manglar. El estudio se realizó en la Reserva de Juan Venado en la costa pacífica de Nicaragua. Los resultados de este trabajo muestran la importancia de los pigmentos del ciclo de las xantofilas en la aclimatación a diferentes ambientes lumínicos y al estrés por sequía. Por otro lado, se concluyó que la salinidad afecta a la capacidad de respuesta fenotípica de las especies del bosque de mangle de manera diferencial. Las especies responden con gran plasticidad mediante atributos fisiológicos inter-específicos, los cuales cambian dependiendo del estadio de desarrollo de la especie. Este trabajo servirá como base para las decisiones de gestión del manglar y del bosque seco en la Reserva de Juan Venado, así como base para los estudiantes de Biología nicaragüense en educación ambiental y ecofisiología de estas especies.

La creciente demanda de producción de alimentos ha llevado a que el uso de fertilizantes nitrogenados se haya incrementado 10 veces desde la Revolución Verde, convirtiendo los suelos agrícolas en ambientes altamente nitrificantes que aumentan la contaminación por nitrógeno, si no se ajustan las dosis a las necesidades del cultivo. Además, para ralentizar la actividad nitrificante del suelo y disminuir las pérdidas de nitrógeno se han desarrollado inhibidores sintéticos de la nitrificación (SNIs). Los SNIs 3,4-dimetilpirazol fosfato (DMPP) y la mezcla isomérica 2-(3,4-dimetil-1H-pirazol-1-il) succinato (DMPSA) pueden mantener el amonio en el suelo durante más tiempo reduciendo las emisiones de óxido nitroso. No obstante, no está claro si las condiciones futuras de cambio climático, como una mayor concentración de CO2 atmosférico, pueden afectar su eficiencia. Por otro lado, su modo de acción parece estar relacionado con su capacidad para quelar los cationes Cu2+ que necesita la enzima amonio monooxigenasa (AMO), pero no hay datos experimentales en cultivos puros de nitrificantes que puedan confirmalo. Por lo tanto, se necesita una mejor comprensión de la eficiencia y del modo de acción de los SNIs para lograr una agricultura sostenible. A pesar de que el DMPP y el DMPSA son herramientas eficientes para minimizar las pérdidas de nitrógeno, no son ampliamente adoptados por los agricultores debido a su limitada estabilidad biológica y movilidad de suelo. Sin embargo, las sustancias alelopáticas de exudados de raíces de cultivos como el sorgo, conocidas por su actividad como inhibidores biológicos de la nitrificación (BNIs), se han mostrado como una alternativa prometedora. Esto hace que el sorgo sea una opción adecuada para reducir las pérdidas de nitrógeno al ser usado como cultivo de cobertura en la rotación de sorgo/trigo de invierno. No obstante, dado que la exudación de BNIs está relacionada con el estado fisiológico y el desarrollo de la planta, también es necesario determinar los efectos de estreses abióticos como la sequía sobre la liberación de BNIs. Por otro lado, los cultivares de trigo modernos carecen de la capacidad de exudar BNIs. Afortunadamente, la región cromosómica que controla la producción de BNIs en Leymus racemosus, un pariente silvestre del trigo, se introdujo con éxito en dos cultivares de trigo de élite, lo que les confirió la capacidad de inhibir la nitrificación en suelos ácidos bajo nutrición amoniacal. Esta tecnología BNI presenta un uso potencial a nivel mundial y, por lo tanto, debe probarse en diferentes tipos de suelo y con diferentes tipos de fertilizante con el objetivo de evaluar la respuesta de estos trigos élite a la nutrición nítrica y amoniacal en el marco de prácticas agronómicas respetuosas con el medio ambiente. Para finalizar, esta tesis concluye que el control de la nitrificación nos permite avanzar hacia una agricultura sostenible al reducir las pérdidas de nitrógeno reactivo al medio ambiente derivadas del uso de fertilizantes con base amoniacal.

This PhD thesis is focused on to two topics related to wine-making: (i) the study of the influence of novel oenological techniques on the phenolic composition of wine during its elaboration, and (ii) the valorization of grape pomace waste resulting from wine elaboration. Phenolic compounds occur naturally in plants and fruits. Red grapes are one of the fruits with the highest content of phenolics, which account for their color, flavor and antioxidant and anti-inflammatory properties. Wine is a popular and appreciated beverage elaborated through a fermentation process from grape must and grapes. In Spain, red wine is of great importance, especially in the area of La Rioja, where red wine has a Protected Designation of Origin (PDO). Red wine is rich in phenolic compounds, mainly anthocyanins and anthocyanin derivatives. Pedoclimatic conditions of gravevine areas affect the chemical composition of grape berries, and thus of the wine produced from these grapes. Wine elaboration techniques also influence the composition of wine and its evolution during the wine-making process and its maturation in the long term. In this work, different oenological technologies were evaluated to study their influence on the phenolic composition of wine during its elaboration process. For this purpose, wine elaborations were performed in 2018 and 2019 in Bodegas Faustino, under controlled conditions at pilot scale, employing the main grape cultivar under the PDO "Rioja" named Tempranillo. The oenological technologies studied were: (i) microoxygenation during malolactic fermentation (MLF); (ii) ionic exchange technologies to lower the pH of the grape must at the beginning of alcoholic fermentation (AF); (iii) tannin addition at the beginning of AF; and (iv) the use of a mixture of must from different grape cultivars. An experimental design including all the variables of the oenological technologies was carried out, and the wine elaborations were monitored and sampled from the start of AF until the end of MLF. In the must and wine samples, 68 phenolic compounds (13 anthocyanins, 27 anthocyanin derivatives and 28 tannins) were determined during the wine-making process by HPLC-DAD and HPLC-DAD-ESI(+)-MS/MS. The concentration phenolic profiles of 8 anthocyanins and anthocyanin derivatives, selected because of their relevance in wine characteristics, were treated mathematically in order to study their evolution kinetics, i.e. extraction from grape, formation and degradation. The kinetic constants were statistically compared (i) between different compounds under the same oenological conditions, in order to study their different stability and evolution kinetics; and (ii) between different oenological conditions employed during wine elaboration, to observe the influence of the oenological techniques on the evolution kinetics. Results of the concentration measurements and the consequent kinetic study showed that the main anthocyanin derivatives present in must and wine are pyranoanthocyanins (i.e. Vitisin A, Vitisin B and derivatives with vinylphenol), followed by anthocyanin-flavan-3-ol condensation products, both direct (F- A+ or A+-F) or indirect, linked by an ethyl bridge (A+-ethyl-F). Vitisin B reaches higher concentration levels than the other compounds during wine elaboration; however, its stability is lower in the long term, leading to a higher degradation of the compound and a lower concentration in wine at the end of fermentations. In contrast, Vitisin A shows a higher stability during fermentations, leading to a more important contribution of this compound to wine color at the end of the elaboration. Malvidin-3-O-glucoside-vinylphenol showed a similar stability as Vitisin A, and thus, it also contributes to wine color. Among the anthocyanin-flavan-3-ol condensation derivatives, the order of stability found is F-A+ > A+-ethyl-F > A+-F; catechin-malvidin-3-O-glucoside (F-A+) being the most important regarding wine color contribution at the end of fermentations. Related to the studied oenological variables, the use of a secondary grape cultivar mixed with the main grape cultivar Tempranillo compared to the use of the single main grape cultivar, led to an increase in the formation constants of pyranoanthocyanins and a decrease in those of anthocyanin-flavan-3-ol condensation products. The application of ionic exchange resulted in a decrease in the concentrations of pyranoanthocyanins and an increase in the concentrations of the anthocyanin-flavan-3-ol condensation products at the end of the fermentations. The addition of tannins and the use of microoxygenation during MLF did not produce significant changes in the concentration of the studied compounds or their kinetic constants. Grape pomace residues from the wine elaborations were employed in order to obtain extracts rich in phenolic compounds with potential cosmetic applications. These extracts were analyzed by HPLC-DAD and HPLC-DAD-ESI(+)-QToF/MS: 13 anthocyanins were identified and quantified, and 24 minor phenolics (flavan-3-ols, flavonols, hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids) were identified. The extracts were formulated in liposomal vesicles, i.e. liposomes and transfersomes, with the aim of enhancing their health beneficial properties and making them suitable for application on skin. The nanoformulations prepared were characterized in terms of size, shape and stability by transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS) and zeta potential, and their antioxidant activities and total phenolic contents were assayed by means of the DPPH and FRAP and Folin-Ciocalteu assays respectively. Furthermore, the cytocompatibility of the nanoformulations containing the extracts, as well as their inhibition capacity of intracellular Reactive Oxygen Species (ROS) generation were evaluated. Nanoformulation of the extracts obtained from the grape pomace residues of wine-making process yielded stable, safe, effective and usable formulations for the treatment of skin under oxidative stress conditions. The in vitro studies highlighted the ability of the vesicle formulations to counteract ROS overproduction, enhancing the effect of the extracts in the cells.

Actualmente, uno de los mayores limitantes en la producción agrícola es el desarrollo de enfermedades en los cultivos, principalmente de aquellas generadas por organismos edáficos. La biodesinfección del suelo para el control de enfermedades edáficas mediante la incorporación de materia orgánica y un acolchado plástico se presenta como una alternativa a la aplicación de plaguicidas sintéticos más sostenible y comprometida con la salud humana y el medio ambiente. El empleo de subproductos agroalimentarios como enmiendas orgánicas en la biodesinfección demostró efectividad contra el nematodo Meloidogyne incognita y el hongo Fusarium oxysporum f. sp. lactucae en explotaciones comerciales de lechuga afectadas. También aumentó la fertilidad del suelo y mejoró su composición microbiana favoreciendo el correcto desarrollo de los cultivos posteriores al tratamiento. Por lo tanto, el uso de estos subproductos, además de mejorar las condiciones de salud del suelo, fomenta la implantación de una economía circular en la producción agraria.

El nitrógeno (N), debido a su baja disponibilidad en los ecosistemas terrestres, es el nutriente que más directamente influye en la producción vegetal y en el contenido de proteína de los cultivos de grano. Para satisfacer la creciente demanda de alimentos, las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados son un factor crucial. La síntesis de fertilizantes minerales nitrogenados requiere grandes cantidades de energía, y en ocasiones sus aplicaciones no se hacen en dosis o momentos correctos provocando pérdidas de N en el medioambiente. Por otro lado, en las últimas décadas el sector ganadero ha experimentado un importante crecimiento, y con ello, ha aumentado la disponibilidad de subproductos orgánicos. Además de otros aspectos positivos para el suelo, la aplicación de subproductos de origen ganadero, devuelve parte de los nutrientes extraídos por los cultivos al suelo, lo que contribuye a la fertilidad del mismo y a la consiguiente productividad de los cultivos. El objetivo general de este trabajo es la mejora de la fertilización nitrogenada del cultivo de trigo en condiciones de clima mediterráneo húmedo, mediante la generación e integración de nuevo conocimiento acerca de: (i) los factores que influyen en la capacidad de mineralización de varios suelos de Araba; (ii) la disponibilidad de N tras el aporte de distintos subproductos orgánicos de origen ganadero; y (iii) la utilización de sensores ópticos proximales para el ajuste de la dosis de N mineral aportado y para el seguimiento del estado nitrogenado del cultivo en estados fenológicos clave. Los resultados obtenidos mediante este trabajo indican que: (i) la heterogeneidad del suelo influye en la variabilidad de la dinámica del N mineral a lo largo del ciclo de cultivo; (ii) las dinámicas de mineralización de la materia orgánica son muy variables, dependiendo de la tipología y composición bioquímica de cada subproducto orgánico de origen ganadero aportado al suelo. Así, la gallinaza y el purín son una fuente importante y muy rápida de N mineral para el cultivo, mientras que la tasa de mineralización del estiércol es baja; (iii) las lecturas normalizadas de los sensores proximales de campo Yara N-TesterTM y RapidScan CS-45 (NDVI y NDRE) permiten el ajuste de la dosis de nitrógeno al inicio de la etapa de encañado del trigo cuando se aplica purín de vacuno en fondo y cuando no se aplica fertilización de fondo orgánica; (iv) los valores absolutos de NDVI obtenidos con el sensor proximal RapidScan CS-45 posibilitan el seguimiento del índice nutricional nitrogenado (INN) a lo largo del ciclo de crecimiento del cultivo de trigo; (v) en los estados fenológicos aparición del segundo nudo, hoja bandera y mitad de floración, el rango de valores NDVI umbral obtenidos con el sensor proximal RapidScan CS-45 para la obtención de los mayores rendimientos productivos en el cultivo de trigo es de 0,70 ¿ 0,75; (vi) el sumatorio de los valores NDVI en los estados fenológicos inicio de encañado, aparición del segundo nudo, hoja bandera y mitad de floración, es un indicador de la variabilidad del rendimiento productivo del cultivo de trigo; (vii) cuando el rendimiento de trigo es inferior a 8000 kg ha-1, las lecturas obtenidas con el medidor de clorofila Yara N-TesterTM en la mitad del periodo de floración estiman los valores de proteína en grano. En conclusión, los sensores proximales permiten determinar el estado nutricional del trigo en distintos momentos de su ciclo productivo y ajustar la dosis de N para optimizar la producción y el contenido de proteína del grano. La planta engloba la variabilidad en el aporte de N por parte del suelo, por parte de los subproductos ganaderos y el efecto de la climatología del año, por lo que este sistema de control es muy apropiado desde un punto de vista productivo y ambiental, contribuyendo así a la sostenibilidad de los sistemas de producción agrícola.

Lurzoruen gazitzea landareen hazkundea eta elikadura-segurtasuna larriki mehatxatzen dituen estres abiotiko garrantzitsuenetakoa da. Klima-aldaketak eta nekazaritza-jarduera desegokiek, labore-lurren gazitzea sustatu dezakete. Azken urteetan landare espezie halofitoak labore gisa erabiltzea proposatu da, tartean kinoa. Klima-aldaketa globalak landareen karbono-asimilazioari, hazkundeari, biomasa banaketari eta mantenugaien hartzeari eragingo die aurreikusitako CO2 atmosferikoaren eta tenperaturaren aldaketek eragin hadiak eragiteko modukoak izatea espero baita. Gainera, aldi berean gertatuko dira tenperatura altuagoa izatea eta atmosferako CO2 kontzentrazioa handitzea. Kinoa barietate ezberdinen arteko gazitasunarekiko tolerantzia mekanismoen alderaketa eginda, emaitza hauek iradokitzen dutenez, kinoaren aldakortasun genetikoa eta gazitasunarekiko tolerantziaren konplexutasuna direla eta, ez dira kontuan hartu behar ezaugarri bakar eta espezifikoak kinoan gazitasunarekiko tolerantzia definitzeko. Aitzitik, badira oraindik ezezagunak diren edo ikerketa sakonagoak eskatzen dituzten tolerantzia mekanismoak. Horregatik, puxika zelula epidermikoen funtzioa sakonago ikertu nahi izan zen lan honetan. Emaitzek azpimarratzen dute konplexua dela landareek gazitasun-estresari ematen dioten erantzuna, eta iradokitzen dute puxika zelulek beste funtzio batzuk ere izan ditzaketela, gatzarekiko tolerantziatik harago. Kima-aldaketa baldintzetan, atmosferako CO2 kontzentrazioa handituz, landarearen hazkuntza sustatu egin zen, zurtoinaren biomasa bereziki asimilazio-tasa handiagoen eta NARaren igoerak bultzatuta. Gazitasun-estres egoeran ordea, fotoarnasketa tasa altuagoek kontra egingo zioten tenperatura altua eta CO2 handiko baldintza konbinatuetan espero zitekeen hazkuntzaren gorakadari. CO2 handiak are gehiago handitu zuen gazitasunarekiko tolerantzia Na+ translokazioa hostoetara murriztuz eta K+ maila altuagoei eutsiz baina gazitasunak uraren erabileran zuen eragina ez zen arindu CO2 handiko edo CO2 handiko eta tenperatura altuko baldintzetan uraren erabileraren efizientzia mantendu baitzen ingurugiro baldintzen artean. Halaber, kinoaren hazkuntzarako garrantzitsuagoa da karbonoa asimilatzea eta karbohidratoak metatzea nitrogenoaren metabolismoa baino. Hori guztia kontuan hartuta, lan honek erakusten du kinoak gaitasun handia duela klima-aldaketara egokitzeko; izan ere, gai izan da gazitasun-kontzentrazio handiei aurre egiteko eta gazitasunarekiko duen tolerantzia-erantzuna hainbat modutan doitzeko, CO2 eta tenperaturaren arabera. Aurkikuntza hauek informazio garrantzitsua eskaintzen dute gazitasunaren, tenperatura altuaren, CO2 handiaren eta landareen garapenaren arteko elkarrekintza konplexuak ulertzeko.

Los antibióticos son herramientas indispensables para el tratamiento de las enfermedades infecciosas, tanto en salud humana como en veterinaria. Sin embargo, el uso incorrecto y abusivo de los antibióticos ha acelerado la emergencia y diseminación de las resistencias a los antibióticos, convirtiéndolo en uno de los principales problemas sanitarios a nivel mundial. El abordaje de esta creciente problemática requiere de una aproximación bajo la perspectiva One Health. Las enmiendas orgánicas de origen animal y urbano son un importante reservorio de antibióticos y bacterias resistentes que albergan y transfieren genes de resistencia a los antibióticos. La fertilización de los suelos agrícolas con enmiendas orgánicas es una práctica muy común debido a su potencial agronómico, así como al hecho de ser una alternativa sostenible y económicamente viable al uso de fertilizantes de síntesis. Sin embargo, la aplicación de estas enmiendas conlleva riesgos potenciales asociados a la diseminación de residuos de antibióticos, bacterias resistentes, genes de resistencia a antibióticos y elementos genéticos móviles. El citado riesgo varía en función de numerosos factores: la abundancia del gen que concede la resistencia, la naturaleza y concentración del antibiótico específico al que confiere resistencia dicho gen, su potencial para transferirse horizontalmente, su presencia en un posible patógeno humano, etc. En este trabajo de investigación se ha evaluado el riesgo del resistoma en los agroecosistemas a lo largo de la vía de exposición que va desde las propias deyecciones animales y enmiendas orgánicas hasta los suelos enmendados y los cultivos agrícolas en ellos crecidos. Nuestros resultados indican que (i) el empleo de enmiendas orgánicas representa una importante vía de entrada del resistoma al medioambiente agrario, aunque el riesgo asociado disminuye a lo largo de la vía de exposición ¿enmienda ¿ suelo ¿ cultivo¿; (ii) la evaluación de la calidad de las enmiendas orgánicas debe incluir una caracterización físico-química y microbiológica exhaustiva, considerando los riesgos derivados de su uso en relación con la presencia de contaminantes emergentes (e.g., antibióticos, genes de resistencia a los antibióticos); (iii) la adición repetida de oxitetraciclina ejerce una presión selectiva sobre las comunidades procariotas edáficas e induce su resistencia frente a dicho antibiótico a corto plazo; (iv) el origen de las enmiendas (ganadería ecológica versus ganadería convencional) no influye en la magnitud del resistoma en el sistema ¿enmienda ¿ suelo ¿ cultivo¿, al mismo tiempo que el perfil del resistoma de cada tipo de enmienda orgánica (i.e., estiércol fresco, estiércol envejecido, purín) no se mantiene a lo largo de dicha vía de exposición; (v) la aplicación de lodos de depuradora urbana digeridos anaeróbicamente y deshidratados incrementa la magnitud del resistoma y moviloma del suelo; y (vi) el tratamiento de las enmiendas orgánicas mediante digestión anaerobia y adición del biochar reduce la magnitud del resistoma y moviloma. Se concluye que la aplicación de enmiendas orgánicas de origen animal o urbano al suelo agrícola representa una preocupante vía de entrada de resistencias a los antibióticos en los agroecosistemas. La optimización del tratamiento y manejo de las enmiendas orgánicas, previamente a su aplicación al suelo, es una opción idónea para mitigar el riesgo asociado al resistoma y, en particular, la entrada de resistencias a los antibióticos a los agroecosistemas.

Holm oak decline in Iberian dehesas, characterized by defoliation, is caused by the interaction of multiple stressors such as climate change-related events, invasive pathogens, and changes in dehesa use and management. Understanding the biochemical and physiological mechanisms preceding and following defoliation remains a challenge. This dissertation conducted a regional study across nine dehesa sites, examining physiological, morphological, and ecological responses underlying holm oak decline. Findings highlighted the oak's ability to acclimate through adjustments in photoprotective compounds. Defoliation occurred when stress exceeded certain physiological threshold. This was accompanied by a shift in energy allocation towards soil resource acquisition through fine root phenotypic plasticity. The loss of tree health was related to upregulated biogeochemical steps and the subsequent downregulation of soil nutrients, forming a tree-soil feedback loop. This research deepens our understanding of holm oak decline, including factors defining tree health, underlying mechanisms, and tree-soil interactions, offering insights to predict, prevent, and mitigate this decline in Iberian dehesa.

Water, the most abundant molecule in our planet, is truly and empirically accepted as an essential component to sustain life on Earth. The extraordinary properties of this unique and universal "matrix of life" have served over this quarter century, as the driving force -for theoreticians and experimentalists- to perform novel research on the structural basis and molecular dynamics taking place in very different environments. Even today, scientists are still discovering new phenomena in water, especially at the nanoscale. When referred to bio-systems, water is usually seen as the liquid environment -or "matrix"- where physical and chemical processes take place. Here, the molecules of life are thought of being wet - this is, completely immersed in liquid water or, in other words, in fully hydrated conditions. While this is true for most living cells, a surprising number of processes require merely traces of water, which could be vapor or a layer as thin as nanometers. Indeed, this is observed in situations in which, because of extremes of either heat or cold, liquid water is scarce. Here, the hydration layer of the molecules - understood as an entity that differs from bulk water - should confer certain stability to keep the biomolecules still functional; and the processes taking place at the air interface should play a prominent role. In this direction, the transmission of many airborne viruses - through respiratory droplets (e.g. aerosols) - requires, actually, survival in dry conditions. Influenza A virus (IAV), is one of the best-known cases, for which the transmission and thus survival is tightly connected to seasonal factors. Seasonal epidemics generally occur during winter, when air temperature and humidity are low. Under these conditions, the respiratory droplets must confer some structural stability to the contained viruses; membrane collapse, for example, should be in principle avoided. However, this assumption is yet poorly understood and experimental data based on biophysical methods are in great demand to obtain a solid knowledge base for the restriction of virus transmission (in addition to vaccination strategies). This thesis represents the outcome of almost four years of intensive work in the field of applied biophysics in life sciences. Here, we explore the possibilities to mimic IAV by different model systems, by mostly focusing on the role of hydration water under various relative humidity (RH) conditions, namely hydration scenarios. To date, RH has been one of the less investigated and one of the most controversial environmental factors. Its effect on the transmission, survival and stability of the virus is still under debate, while the influence of air temperature, e.g., is quite well established. In this research, the structure of the IAV envelope is studied in a range of model systems and by a combination of very different techniques, providing new biophysical insights on the micro- and nanoscale, from dehydrated to fully hydrated conditions. To this aim, in Chapter 1, an overview on the scope of this investigation is provided. Here, we include an introduction to the science of hydration as well as information on the IAV structure and seasonality. Finally, a detailed description on the developed model systems is offered. In Chapter 2, all the experimental techniques used in this research are described and specific considerations for performing the experiments are noted. In Chapter 3, we introduce the first approximation for mimicking the IAV surface "spike" glycoproteins (e.g. hemagglutinin, HA), by the use of dimannoside-coated gold nanoparticles (Dimanno-AuNPs). In this research, unprecedented observations on the stability and hydration water of the particles are provided in solution - by Dynamic Light Scattering (DLS) and Zeta Potential (ZP) measurements - and after dehydration - by a combination of Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy (VSFG), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) and Electron Microscopy. The study culminates with the analysis on the water adsorption of the particles at various RH, by Atomic Force Microscopy (AFM). Here, the hydration properties of mannosides in air, from dehydrated states to high humidity are demonstrated. In Chapter 4, a supported lipid bilayer, with HA anchored at high surface density is proposed as a "flattened" and simplified model of the IAV envelope. The effect of RH is investigated, in complete cycles of hydration, dehydration and rehydration. The membrane performance is evaluated in terms of structure and dynamics, by combining Confocal Fluorescence Microscopy, Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS), Line-Scan Fluorescence Spectroscopy (LSFCS) and AFM. The macro- and nanoscopic effects of HA under dehydration stress are studied in detail, revealing new information on the stabilization mechanisms operating in the IAV envelope at low RH. In Chapter 5, the use of a monovalent Live Attenuated Influenza Vaccine (LAIV) as a more realistic model of the IAV envelope is explored. Here, revealing the morphological features of the IAV envelope is attempted by performing AFM on solid surfaces in air. Although the detailed surface structure of the virus is not revealed, complete assembled viruses are identified after dehydration, suggesting that adsorbed LAIV can be used as an analogous model of the IAV envelope during airborne transmission. Finally, Chapter 6 contains concluding remarks for the studies presented in this thesis, and an outlook to further investigations.

El pino radiata es una conífera de crecimiento rápido originario de la costa de California que se ha importado en muchos países, en concreto en España se empezó a emplear en reforestaciones a mediados del sigo XX y desde entonces su uso se ha popularizado debido a la rentabilidad económica. Sin embargo, el fututo incierto debido al cambio climático, así como la necesidad de mejorar su productividad hacen evidente la necesidad de su investigación. En esta tesis doctoral hemos tratado desde un enfoque genético tratar de avanzar en el entendimiento de la especie en la Comunidad Autónoma Vasca, así como en el resto de España, útil para su mejora en aspectos de productividad y sostenibilidad. Todo ello se ha abordado en primer lugar mediante la caracterización genética de la especie en España analizando su diversidad genética neutral y analizando de la misma manera el material disponible y que se seleccionó en los inicios del programa de mejora del Pino radiata en el País Vasco allá en 1984. Asimismo, esta tesis se ha centrado en dos caracteres relacionados con la productividad de la especie, así como la sostenibilidad como son la calidad de madera para uso estructural y la respuesta a la sequía respectivamente. Los resultados aportan información útil para la mejora genética del Pinus radiata en la Comunidad Autónoma Vasca y el resto de las plantaciones españolas. Finalmente y colateralmente se diseñó un flujo de trabajo útil para la evaluación de procesos bioinformáticos empleados en el marco de este estudio.

Located in the North of Spain, Basque Country has edaphoclimatic conditions that have allowed the establishment and development of an important forestry sector at European level. In this sense, 54.8% of the territory is dedicated to natural and cultivated forests. The most cultivated species in the Basque territory is Pinus radiata, whose first report of forest plantation establishment dates back to 1897. From that year to the present, its cultivation has increased in the Basque Country, reporting for the year 2022 the largest total area (25.9 %) and the highest forest productivity (80-85% of the annual cuts). Pinus radiata, has a natural distribution from the central coast of California to Mexico. The versatility and quality of the wood, together with the rapid growth of the species, has allowed its plantations to extended to countries such as Australia, Chile, New Zealand, South Africa and Spain. However, in recent years P. radiata in the Basque Country has been affected by several diseases caused mainly by fungi: Pine canker caused by Fusarium circinatum, Dothistroma needle blight caused by Dothistroma septosporum and Dothistroma pini, and brown spot needle blight caused by Lecanosticta acicula. This last disease has affected 3,300 ha in Gipuzkoa, Basque Country. In addition, P. radiata plantations in the Basque Country have decreased from 123,921 ha (2016) to 102,488 ha (2022), a decrease that coincides with a historical outbreak of the needle blight during the years 2018-2019. For all of the abovementioned reasons, and together with the increase in the world population that causes a strong demand for timber and non-timber products, the forestry sector and HAZI (www.hazi.eus) proposed a list of candidate species to be used, compatible with the demand of the forestry sector, as well as socially and culturally accepted. Using the list of possible alternative species, the following were selected for this study: Cryptomeria japonica (Thunb. ex L.f.) D. Don, Pinus ponderosa (P. Lawson and C. Lawson), Sequoia sempervirens ( D.Don). Endl and apparently tolerant genotypes of P. radiata. However, these species display desirable characteristics for clonal propagation at maturity, when traditional vegetative propagation and rooting are unfeasible. Therefore, the development of alternative methods of propagation, such as in vitro propagation, for these species is necessary. In vitro propagation through tissue culture could be performed mainly by organogenesis or somatic embryogenesis; those techniques combined with traditional ones could be efficient for the vegetative propagation of the abovementioned alternative species. In addition, these methods allow to improve the quality, yield and health of commercially valuable forest species. In this context, organogenesis in species of the Pinaceae family is generally restricted to zygotic embryos, part of them or young seedlings as initial source of explant, and attempts to clone selected adult individuals have been feasible but have faced several difficulties. In this regard, in our laboratory at Neiker, several in vitro propagation protocols have been successfully developed for Pinus pinaster Ait, Pinus sylvestris L., Pinus pinea L., Pinus radiata or Pinus halepensis among others. Taking into account all this information, the general hypothesis of this work is that the modification of the physico-chemical environment in the micropropagation process can influence the regeneration efficiency of elite trees of forest species such as C. japonica, P. ponderosa and S. sempervirens to be considered as an alternative to P. radiata in the Basque Country. The second hypothesis to be corroborated is that adult P. radiata trees with apparent tolerance to pine needle blight can be used as a source of material for in vitro propagation. In this context, the objective of the first chapter of the thesis was to analyze the influence of collection dates and different concentrations of 6-benzyladenine (BA) in the shoot induction phase, as well as the effect of different types of light on growth success of rooting. Also, the effect of physico-chemical factors in the content of amino acids and carbohydrates in the shoots developed in vitro was studied. Although reinvigorated shoots were obtained in both BA concentrations (22 or 44 ¿M), the highest BA concentration showed the best results in terms of shoot induction and number of shoots per explant when the explants were collected in the first week of February. In addition, in shoots developed in vitro a significantly higher differences were found in the different phases of the rooting process in the levels of fructose, glucose and sucrose and in the threonine and tyrosine contents. The objective in the second chapter was to optimize the micropropagation method of C. japonica using adult trees as a source of plant material. In a first experiment, the effect of different types of initial explants and three basal culture media on shoot induction was studied. In addition, two sucrose concentrations and two light treatments (LED versus fluorescent lights) were tested for rooting stage. In a second experiment, the effect of different growth regulators (6-benzylaminopurine, metatopolin and thidiazuron) on shoot induction and subsequent phases of the organogenesis process were analysed. As main results, the highest number of shoots was obtained when using basal explants longer than 1.5 cm of length grown in the QL culture medium (Quoirin and Lepoivre, 1977). The shoots produced a higher number of roots when grown under red LED lights. Finally, root induction was significantly higher in shoots previously induced with meta-topolin. The third chapter was focused on the analysis of the influence of different types of explants, basal culture media, cytokinins, auxins and light treatments on the in vitro propagation success in P. ponderosa. In this sense, whole zygotic embryos cultured in 44 ¿M BA performed better in terms of explant survival. For shoot organogenesis, whole zygotic embryos and half LP (LP medium, Quoirin and Lepoivre, 1977, modified by Aitken-Christie et al., 1988) macronutrients were selected. Regarding the light treatments applied, a significantly higher percentage of rootable shoots was obtained under blue LED light. However, the percentage of acclimatization was higher in shoots previously cultivated under fluorescent light. Furthermore, anatomical studies using optical and scanning microscopy showed that light treatments promoted differences in anatomical aspects in in vitro shoots; needles of plantlets exposed to red and blue LEDs showed less stomata compared with needles from plantlets exposed to fluorescent light. The objective in the fourth chapter was to optimize the micropropagation of adult elite trees of S. sempervirens. To accomplish this objective, the effect of different cytokinins (6-benzylaminopurine, meta-Topolin and Kinetin), and four types of explants in shoot induction were studied. At rooting stage, the effect of two types of auxins was evaluated: 1-naphthalene acetic acid, indole-3-butyric acid and a mixture of both. The best induction rate was obtained when apical explants longer than 1.5 cm were induced with 4.4 ¿M BA. Regarding the rooting, shoots previously induced in 4.4 ¿M BA and rooted in a culture medium with 50 ¿M 1-naphthalene acetic acid showed the best result. However, acclimatization was better when explants had been cultivated with Kinetin and rooted in a culture medium with indole-3-butyric acid. Our study demonstrated that in vitro culture method can be used as an alternative for the propagation of elite individuals of C. japonica, P. ponderosa, P. radiata and S. sempervirens. Furthermore, the success of in vitro propagation in these species is influenced by genetic factors, collection dates, and physicochemical conditions of the culture environment.

El hierro y el nitrógeno son nutrientes cruciales para las plantas. El hierro está implicado en funciones vitales como la fotosíntesis y la síntesis de proteínas, pero a menudo es poco biodisponible en suelos con pH neutro o alcalino. El nitrógeno, absorbido principalmente como nitrato o amonio, suele ser escaso en suelos agrícolas, requiriendo la adición de fertilizantes. El uso de amonio como fertilizante, aunque reduce la contaminación ambiental en comparación con el nitrato, puede causar estrés en las plantas, manifestándose en amarillamiento de hojas y pérdida de biomasa debido a varias alteraciones fisiológicas y bioquímicas. Se ha descubierto que existe una interacción entre hierro y amonio, pero en función de las condiciones ambientales puede ser tanto beneficiosa como perjudicial para las plantas. Los resultados expuestos en esta tesis han demostrado que los factores de transcripción MYB28 y MYB29, los cuales son necesarios para la tolerancia al estrés por amonio en Arabidopsis thaliana, desempeñan un papel esencial en la tolerancia a la deficiencia de hierro. La función reguladora de MYB28 y MYB29 en el control de la homeostasis del hierro recae en su capacidad para controlar la distribución del metal, además de alterar la expresión de elementos reguladores de la homeostasis del hierro. Además, en esta tesis se demostró que el estrés amoniacal provoca síntomas de deficiencia de hierro en plantas. Esto se evidenció con el hallazgo de que los mutantes sensibles a la deficiencia de hierro también eran sensibles al estrés por amonio, mientras que los mutantes con mayor tolerancia a la deficiencia de hierro parecían tolerar mejor el estrés amoniacal. Asimismo, se observó que la tolerancia al estrés a

La fotosíntesis es el proceso biológico que transforma la energía lumínica del sol en energía química y tiene lugar en los cloroplastos. Sin embargo, suele verse influido por las condiciones del ambiente y por ello, los organismos fotosintéticos han desarrollado mecanismos para adaptarse y mantener su capacidad fotosintética frente a condiciones adversas. Algunos de estos mecanismos están relacionados con la protección a nivel de los cloroplastos y el mantenimiento de su funcionalidad, entre otros la protección de la membrana tilacoidal. Por ello, el objetivo de esta tesis es profundizar en los mecanismos que intervienen en la protección de la membrana tilacoidal, mediante el estudio de cambios en su estructura y composición lipídica. En general, los resultados mostraron que los organismos fotosintéticos son capaces de hacer frente a condiciones adversas mediante una modulación precisa de la composición lipídica y la estructura de las membranas tilacoidales. En concreto, cambios en los platoglóbulos, así como presencia de lípidos estabilizadores de la bicapa y metabolitos fotoprotectores son clave para mantener la funcionalidad de las membranas tilacoidales y la actividad fotosintética en condiciones adversas

La vid (Vitis vinifera L.) es un cultivo de gran importancia económica a nivel mundial. Algunas enfermedades pueden infectar la uva y generar la pérdida de la cosecha, generando graves pérdidas económicas. Tal es el caso del mildiu de la vid, causada por el oomiceto Plasmopara viticola. La protección frente a este patógeno se basa principalmente en el uso de fitosanitarios convencionales y derivados del cobre, que tienen un gran impacto ambiental. En este contexto, esta tesis aborda la protección del viñedo desde un punto de vista sostenible, utilizando productos comerciales alternativos a los fitosanitarios convencionales, con un especial enfoque en cuatro sustancias básicas: cola de caballo, corteza de sauce, lecitina de soja y quitosano. Para ello, se analizó su toxicidad directa frente al patógeno y su capacidad de estimular las defensas naturales de la viña tanto en presencia como en ausencia del patógeno. Los resultados demostraron que todas las sustancias son tóxicas frente al patógeno y que pueden estimular las defensas naturales de la viña, reduciendo significativamente los síntomas de la enfermedad. De entre todos ellos, la corteza de sauce resultó ser la sustancia básica más efectiva, lo que la convierte en una alternativa prometedora en el ámbito de la viticultura sostenible.

Las enfermedades virales se han convertido en uno de los principales problemas fitosanitarios para los productores de pimiento de Euskadi. En esta Tesis se han realizado varias prospecciones a gran escala para conocer cuáles son los virus que mayores daños generan en estos cultivos. En la prospección de 2014 (DAS-ELISA), tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) y potato virus Y (PVY) resultaron los más importantes. PVY resultó más importante en cultivo al aire libre (27,3%) que en condiciones de invernadero (12,3%). Por el contrario, los virus pertenecientes al género Tobamovirus y tomato spotted wilt virus (TSWV) prevalecieron en condiciones de invernadero (28,9% y 5,2%). Todos los aislados de PMMoV detectados se clasificaron como patotipo P1.2. En la prospección de 2019 (Hibridación molecular, HM), se analizaron 21 virus y 2 viroides. Fueron detectados 10 virus pero no se detectaron viroides. El virus más prevalente fue cucumber mosaic virus (CMV, 20,1%) mostrando una incidencia alarmante, en cultivos al aire libre (33,4%). Los tobamovirus y TSWV destacaron en cultivo bajo invernadero y PVY tanto en invernaderos como al aire libre. En análisis realizados en flora silvestre alrededor de parcelas al aire libre de guindilla de Ibarra, algunas especies mostraron infección por CMV pero no por PVY. Por otro lado, se hizo una validación del comportamiento de varias polisondas de HM diseñadas para detectar simultáneamente varios virus que afectan al cultivo de pimiento (poli9, poli12 y poli21). Por otro lado, se detectó un nuevo tobamovirus, chili pepper mild mottle virus (CPMMV), del cual se ha realizado un estudio molecular y epidemiológico. Por último, se llevó cabo un programa de mejora genética por retrocruzamiento, asistido por marcadores moleculares, para introducir genes de resistencia L3 y L4 en variedades locales de pimiento de Euskadi sensibles a tobamovirus.

La patata (Solanum tuberosum L.) es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial y contribuye de forma importante al suministro mundial de alimentos, produciéndose más de 370 millones de toneladas. El cultivo tiene, asimismo, una gran relevancia en la seguridad alimentaria, reducción de la pobreza y mejora de la nutrición humana. Debido a los efectos del cambio climático, las condiciones tienden a ser cada vez más extremas, siendo la disponibilidad de agua uno de los factores limitantes en la producción del cultivo, por lo que es importante poder seleccionar variedades que puedan mantener el rendimiento y hacer frente a las consecuencias del cambio climático. La mejora tradicional de patata es un proceso largo, costoso y con problemas como la naturaleza heterocigota y tetraploide. Durante las últimas décadas se han desarrollado tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS) que cada vez son más asequibles y permiten a los mejoradores identificar alelos específicos beneficiosos que son responsables de las variaciones deseables en los cultivos. Esta tesis intenta abordar el problema del efecto del estrés hídrico como consecuencia del cambio climático en el cultivo de la patata desde distintos puntos de vista. Por un lado, se evaluó la respuesta diferencial de parámetros fisiológicos y de producción en seis variedades de patata bajo condiciones de déficit hídrico. Para ello se llevó a cabo un ensayo de invernadero con las variedades Ágata, Agria, Kennebec, Monalisa, Santé y Zorba. Se tomaron todas las medidas en la hoja más joven completamente expandida y en 4 tiempos distintos: antes del estrés (T0), a los 17 días (T1) y a los 24 días (T2) de retirarlas el riego y 5 días después de regarlas nuevamente (R1). Los parámetros fisiológicos evaluados fueron el contenido y la fluorescencia de la clorofila, contenido relativo de agua (RWC), apertura estomática, conductividad electrolítica y potencial hídrico. Tras el periodo de sequía se cortó la parte aérea de la mitad de las plantas para obtener la biomasa. Se estimaron los parámetros de producción como como número y peso medio de tubérculos, producción, materia seca y almidón. Los parámetros más afectados por el déficit hídrico fueron la apertura estomática y el potencial hídrico. La selección indirecta basada en parámetros asociados al estrés hídrico puede ser una herramienta útil en programas de selección en patata para la identificación de variedades más tolerantes. Por otro lado, con el objetivo de comprender los mecanismos de respuesta al estrés hídrico a nivel de transcriptoma, se llevó a cabo un ensayo en el que se utilizaron las variedades Agria y Zorba para ver la diferencia de expresión de genes entre plantas control y plantas sometidas a estrés hídrico. Para ello, se secuenciaron mediante RNAseq, obteniendo alrededor de 50 millones de transcritos para cada variedad. Al comparar los transcritos significativos obtenidos de las plantas control con las de sequía de la variedad Agria, se vio que 931 genes estaban regulados ¿up¿, es decir, aumentaba su expresión, y 2077 genes estaban regulados ¿down¿, disminuyendo su expresión bajo condiciones de estrés. Cuando se compararon ambos tratamientos en las plantas de la variedad Zorba, se encontraron 735 genes regulados ¿up¿ y 923 genes regulados ¿down¿. Además, se analizaron los transcritos con el fin de averiguar sus funciones y destacar las vías metabólicas potencialmente relacionadas con la tolerancia a la sequía. Para ello se hizo una clasificación de ontología de genes (GO), las cuales describen la función molecular de los productos génicos, su rol en los procesos biológicos y su localización en componentes celulares. En este ensayo se ha visto que las principales ontologías a las que pertenecen los transcritos obtenidos pertenecen a componentes celulares, y más en concreto relacionados con la membrana y la pared celular. Estos resultados proporcionan una información valiosa relacionada con los mecanismos moleculares de tolerancia a estrés hídrico. Por último, se evaluó un panel de 144 genotipos de patata durante dos años para observar la variación biológica de varios rasgos fisiológicos (contenido de clorofila, fluorescencia de clorofila, conductancia estomática, NDVI, área y perímetro foliar) y agronómicos (rendimiento, peso y número de tubérculos, contenido de almidón, materia seca y azúcares reductores). Estas mismas variedades se genotiparon mediante el chip ¿GGP V3 Potato array¿, obteniendo un total de 31190 marcadores SNP que tras el filtrado se quedaron en 18259. Se determinó la subestructura de la población utilizando el software STRUCTURE 2.3.4 y el análisis de mapeo asociativo se realizó utilizando el paquete estadístico GwasPoly. Se detectaron SNPs asociados tanto con los rasgos fenotípicos como con los agronómicos en varios cromosomas y se asociaron con funciones genéticas conocidas. Estos resultados podrían ser útiles para diseñar marcadores y utilizarlos en futuros programas de selección asistida relacionados con la tolerancia a la sequía en patata.

Environmental [CO2] has been rising exponentially over the last century, and projections indicate that this trend will continue through the end of the 21st century. In fact, it is expected that environmental [CO2] will rise from the current 400 ppm [CO2] to 700 ppm [CO2] by the end of the century. As a consequence, global temperatures are predicted to increase by 3 °C, causing drought episodes to increase not only in frequency, but also in intensity. Hence, climate change is one of the major threats to future agriculture and food demand, as future crops will face drought episodes in a high temperature and high [CO2] environment. Drought and high temperature are among the most damaging abiotic stresses for conventional crops such as wheat (Triticum aestivum) and maize (Zea mays). Currently, wheat and maize have great relevance, as they represent more than half of daily calorie intake derived from all cereal sources. Nevertheless, the global reliance on a limited number of conventional crops has put food security at risk, given that future climate change is projected to diminish their growth and yield. Considering that the human population is anticipated to reach 10.4 billion inhabitants by the end of the century, it is essential to identify alternative crops capable of withstanding future abiotic stresses to safeguard future food supply. In this PhD, we have worked with spelt (Triticum spelta) and buckwheat (Fagopyrum esculentum) two underutilized C3 crops as alternative crops for wheat. Likewise, sorghum (Sorghum bicolor), a C4 species primarily cultivated in Africa, was explored as an alternative crop for maize. The main hypotheses were that: 1) Alternative C3 crops spelt and buckwheat will be capable of withstanding drought better than the conventional C3 crop wheat, due to the ancestral genes of spelt and enhanced stomatal regulation and water use efficiency of buckwheat; 2) Modern varieties of the alternative C4 crop sorghum will exhibit superior growth compared to landrace sorghum varieties, but landraces are expected to show enhanced tolerance to water stress; and 3) Given that alternative crops are expected to exhibit greater drought resistance than conventional crops, they are expected to have a higher stress-threshold, and consequently will benefit more from the higher availability of environmental [CO2]. In the Chapter 1 of this PhD thesis, we analysed the response of wheat and spelt to mild drought (one week at 40 % field capacity) and the response of buckwheat to extreme drought (one week at 20 % field capacity) in a greenhouse setup. We found mild drought to extremely damage photosynthetic machinery and processes in spelt, as well as increasing the dehydration in this species. Mild drought also caused decreases in photosynthesis in wheat, although to a lesser extent compared to spelt. On the contrary, upon exposure to extreme drought, buckwheat exhibited enhanced stomatal regulation, higher water-use efficiency, adequate water content within the plant and higher growth than wheat and spelt. Hence, the results of Chapter 1 indicate that buckwheat has the potential to be an alternative crop to wheat, while spelt does not. Chapter 2 delves deeper into the responses of wheat and buckwheat. In fact, we grew these species in a growth chamber under ambient (400 ppm [CO2] and 24/18 °C day/night) and future (700 ppm [CO2] and 27/21 °C day/night) environmental conditions, with and without drought (one week at 20 % field capacity). In wheat, while high [CO2] and high temperature caused dehydration to increase, future drought extremely decreased photosynthesis, the quantum yield of PSII and increased antioxidant metabolism. In contrast, buckwheat exhibited optimal hydration levels, higher photosynthetic rates and increased water-use efficiency under the future conditions, regardless of the drought. This was explained by the enhanced stomatal regulation in buckwheat, and resulted in an outperforming growth compared to wheat. Therefore, the results of Chapter 2 underscore the promising potential of buckwheat as a suitable alternative crop to wheat for the future climatic scenarios. In Chapter 3 the focus shifts towards the response of maize and sorghum to the abiotic stresses of the future: we grew maize and sorghum under ambient (400 ppm [CO2] and 24/18 °C day/night) and future (700 ppm [CO2] and 27/21 °C day/night) environmental conditions, with and without drought (one week at 20 % field capacity). Under high [CO2] and high temperature, sorghum showed an enhanced stomatal regulation and water-use efficiency, which allowed it to consistently allocate resources towards growth. However, despite also exhibiting increased water-use efficiency, maize allocated resources towards maintenance. As a consequence, only the growth of sorghum was promoted. Under future drought, photosynthetic processes and machinery were extremely affected in maize, causing growth to be inhibited. In contrast, the improved stomatal regulation and increased root growth of sorghum led to a more moderate impact on photosynthesis and growth. Thus, the results of Chapter 3 highlight the potential of sorghum as an alternative crop to maize for the future. Lastly, Chapter 4 focuses on characterising the response of modern and landrace sorghum varieties under water-stress, evaluating their performance in both field and glasshouse conditions. We also included a maize variety as a conventional crop reference. In the field, water stress had little effect on the agronomic and photosynthetic traits. Conversely, in the glasshouse, landrace varieties exhibited greater height and a higher proportion of productive tillers. In the same manner, landrace varieties had an improved capacity to preserve water and a higher tolerance to water stress when their root system was not constrained by space. As species, sorghum produced more biomass than maize regardless of the environment and the water treatment. Hence, the results of Chapter 4 indicate that 1) although landraces showed greater tolerance to water stress for certain traits, specific modern varieties also showed high tolerance, 2) sorghum has superior growth under water stress compared to maize and 3) the experiments conducted under controlled environments may not be reproducible in real-field scenarios. Overall, the findings of this PhD thesis suggest that the alternative crops buckwheat and sorghum have the potential be alternatives for wheat and maize in the future, as they are capable of withstanding the abiotic stresses of the future.

La vid (Vitis vinifera L.) es uno de los cultivos más importante de nuestro país. Desde la entrada y establecimiento de Xylella fastidiosa en la región europea, se ha visto necesaria una actuación previa al establecimiento de la Enfermedad de Pierce causada por este patógeno en los viñedos peninsulares. Para ellos, se han visto necesarias ciertas actuaciones relacionadas con la resistencia o tolerancia varietal ya que el uso de sustancias químicas no es efectivo. En este contexto, esta tesis trata de arrojar luz sobre las diferentes respuestas de las variedades europeas frente al patógeno teniendo en cuenta su sensibilidad y la respuesta transcriptómica frente a la infección. Para ello se ponderaron los síntomas manifestados tras la inoculación, se analizaron también las respuestas transcriptómicas diferenciales tras la infección y se hizo una prospección entre un conjunto de variedades con el fin de encontrar el gen de resistencia PdR1. Los resultados muestran como a pesar de ser sensibles a la enfermedad todas las variedades de V. vinifera, lo son en diferente grado, así como los procesos de defensa activados en cada caso. Además, resultan interesantes los resultados de la variedad Hondarrabi Zuri, la cual muestra un potencial interesante.

En este trabajo se han caracterizado estructuralmente 27 flavonas detectadas en extractos de tres especies de plantas de la familia Orchidacea, Dracula vampira, Dracula chimaera y Masdevallia Macrura, mediante técnicas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), combinadas con un espectrómetro de masas con analizador de tipo triple cuadrupolo. Estos extractos mostraron actividad inhibitoria del crecimiento de las tres bacterias ensayadas: S. aureus, E. coli y P. aeruginosa. Se encontraron flavonas, tanto O-glicosiladas como C-glicosiladas; el primer tipo únicamente en la especie Masdevallia Macrura. En el caso de las flavonas C-glicosiladas detectadas todas son di-C-glicosiladas, no encontrándose ninguna mono-C-glicosilada. La aglicona mayoritaria encontrada fue la apigenina; presentándose también en algunas flavonas la luteolina o la diosmetina, pero únicamente en la especie Masdevallia Macrura. Las otras dos especies de plantas únicamente presentaron flavonas C-glicosiladas con la apigenina como aglicona. Las flavonas C-glicosiladas mayoritarias encontradas en las tres especies se han identificado como vicenin-2, schaftósido y tentativamente isoschaftósido. También se han encontrado en cantidad importante en la especie Masdevallia Macrura la flavona C-glicosilada lucenin-2, identificada tentativamente, y las flavonas O-glicosiladas luteolin-7O-glucósido y apigenin-7O-glucósido, identificadas con seguridad. Finalmente, se han detectado varias flavonas di-C-glicosiladas minoritarias con uno de los azúcares acilado con ácido sinápico o ferúlico.