Tesis defendidas

En esta tesis se han desarrollado diferentes formulaciones terapéuticas para la cicatrización de heridas crónicas, ya que éstas son una patología en auge, por el gran aumento de los factores que participan en la cronificación de las heridas, como pueden ser, la diabetes, la obesidad y la vejez. La primera formulación desarrollada fueron nanopartículas lipídicas (portadores lipídicos nanoestructurados o NLCs) que contenían el péptido humano LL37. Su eficacia se evaluó en un modelo in vivo de heridas llevado a cabo en ratones db/db y demostraron una mejora en la cicatrización en comparación con la misma dosis del péptido libre, debido al efecto protector de las NLCs frente a las proteasas del medio. En un siguiente estudio se desarrollaron membranas nanofibrilares compuestas por PLGA y Aloe vera que contenían EGF. Su eficacia también fue evaluada en el mismo modelo animal, y los resultados fueron igual de prometedores que en el ensayo anterior. Para mejorar las propiedades de manejo de las membranas, en el siguiente estudio se le añadieron NLCs, con la hipótesis de mejorar su manejo, elasticidad, oclusividad y facilidad de retirada. Finalmente, desarrollamos un apósito bicapa compuesto de gelatina y quitosano. La capa superior de gelatina fue entrecruzada con lactosa para obtener una capa más rígida que le diera resistencia mecánica al apósito. La capa inferior de gelatina, fue entrecruzada con ácido cítrico y se le añadió quitosano, para obtener una capa con una gran capacidad de absorción. La biocompatibilidad del apósito fue demostrada en un modelo de herida en piel humana realizado ex vivo.

En esta tesis doctoral, se describen y se determinan los crioprotectores clave para la preservación de productos celulares 3D mediante la congelación lenta. Para ello, se han llevado a cabo los siguientes estudios: (i) determinación de crioprotectores óptimos para la congelación lenta de productos celulares 3D que proporciona mejores funciones celulares e integridades que el dimetilsulfoxido tras la descongelación, utilizando células encapsuladas como modelo de estudio; (ii) investigar el hialurónico como crioprotector natural alternativo para la congelación lenta de productos celulares 3D, utilizando las células encapsuladas como modelo de estudio; (iii) el estudio post-congelación de un producto celular clínico, formado de líquido sinovial y plasma rico en plaquetas, donde el ácido hialurónico puede actuar como un crioprotector natural.

Nanotechnology-based non-viral vectors have emerged as promising alternatives to viruses to carry genetic material into target cells due to their ability to overcome many limitations of viral vectors. Although very efficient, viruses present low carrying capacity, expensive and complex production and, most importantly, safety issues related to immunogenic responses and even oncogenesis when randomly integrated in the host genome. In this regard, non-viral vectors present lower immunogenicity, higher nucleic acid packing capacity and ease of fabrication compared to their viral counterparts. In addition, continuous advances in the fields of material science and nano-engineering as well as the diversity of available nanosized material allows the design of multifunctional vectors specifically tailored for different applications. Although most conventional gene therapy strategies based on gene addition use viral vectors, nowadays non-viral vectors are predominant in new investigations based on gene editing due to their favorable characteristics. To date, a wide variety of nanosized non-viral gene delivery vectors have been developed, including cationic lipids, polymers and magnetic nanoparticles. These molecules can be nanoengineered to pass over several extracellular and intracellular barriers and to transport therapeutic genes into specific organs or cell types, including cells in the central nervous system (CNS), one of the most challenging organs for both viral and non-viral gene delivery systems. Among the wide plethora of non-viral vectors, recently emerged niosomes are biocompatible, synthetic, non-ionic surfactant vesicles with a closed bilayer structure. Niosomes have been demonstrated to be effective for retinal gene transfer, an important target organ in many gene therapy strategies due to the existence of several well characterized monogenic retinal disorders. Niosome formulations are based on three principal components -cationic lipids, helper lipids, and non-ionic surfactants. The global chemical properties of these components influence on the physicochemical characteristics of niosomes, such as size, surface charge and morphology, which in turn determine their ability to enter the cells, follow a particular endocytic pathway, deliver the DNA cargo into the nucleus and, therefore, their transfection efficiency. The roles of cationic lipids and helper lipids in the transfection process and efficiency mediated by niosomes have been thoroughly studied in rat retina and brain. However, the influence of the non-ionic surfactant component also needs to be well characterized in order to optimize the design of niosome formulations for retinal gene delivery and be able to achieve persistent and high levels of transgene expression, necessary for biomedical applications in retinal disorders. Successful gene transfer not only depends on the carrier, but the properties of the vectored genetic material are also important. Until recently, most efforts have focused on improving nucleic acid delivery strategies either by modifying non-viral vectors or by employing physical methods such as electroporation. Nevertheless, the enhancement of transfection efficiency can also be achieved by modifying the composition and conformation of the genetic material in order to improve its bioavailability, biocompatibility, durability and safety. In this regard, Development and evaluation of non-viral gene delivery vectors and their combination with hydrogel scaffold technology. 2 minimized expression units devoid of bacterial backbone and that only contain the gene of interest and regulatory sequences such as minicircle (MC) DNA vectors emerge as an attractive alternative to conventional plasmid DNA vectors. In fact, MC DNA vectors offer several advantages over their larger parental plasmid DNA vectors, including enhanced transfection efficiency with sustained transgene expression as well as improved immunocompatibility and safety profiles. High levels of transgene expression mediated by MC DNA vectors have been demonstrated in a variety of organ systems in vivo including the liver, heart and skeletal muscle, but MC DNA technology has not yet been assessed for retinal gene delivery in complex with niosome formulations. Finally, in addition to the optimization of the carrier and the genetic material, a new trend in non-viral gene therapy is to explore novel combined strategies between delivery systems and tissue-engineered scaffolds or matrix design. In fact, these combined approaches may offer relevant advantages such as enhanced stability and reduced toxicity. Moreover, complementing gene transfer with matrix design would allow for an effective, targeted and local DNA delivery, which would promote the applicability of gene therapy in many therapeutic fields such as tissue regeneration. Hyaluronic acid (HA) hydrogels have been widely studied for their biocompatibility as well as their ability to incorporate a wide variety of molecules, including nucleic acids. In addition, polymeric non-viral vectors based poly(ethylene imine) (PEI) have been encapsulated into HA hydrogels with successful local transgene expression, but the biomedical application of PEI derivatives is often restricted due to immunogenicity and cytotoxicity issues. In this regard, niosomes offer several advantages due to their high compatibility with biological systems and low toxicity, but the combination between niosome gene delivery systems and HA hydrogel scaffolds has not yet been explored. In view of these considerations, the main objective of the present work was to evaluate key factors that determine the transfection process and efficiency of non-viral vectors, including the composition and physicochemical properties of non-viral vectors, the composition and conformation of the genetic material and the combination of delivery systems with other technologies such as matrix design. In order to accomplish that purpose, four experimental chapters were designed and developed (Figure 1). Figure 1. Summary of the four experimental chapters developed in the doctoral thesis. Development and evaluation of non-viral gene delivery vectors and their combination with hydrogel scaffold technology. 3 In the first chapter, the transfection efficiency of three different non-viral vectors based on cationic lipids, polymers and magnetic nanoparticles was evaluated and compared. In this chapter, the genetic material employed for transfection corresponded to a therapeutic plasmid coding for the vascular endothelial growth factor (VEGF) and the target organ was the central nervous system (CNS). From this first chapter, we learned that nanoparticles based on lipoplexes, polyplexes and magnetoplexes showed suitable physicochemical characteristics for gene delivery, magnetoplexes showing the highest ability among the three formulations to transfect CNS cells. In addition, the VEGF protein produced by primary neuronal cell cultures transfected with magnetoplexes maintained its bioactivity. In the second chapter, the study focused on niosome based non-viral vectors, specifically on the role of the non-ionic tensioactive component of niosome formulations in retinal transfection processes both in vitro and in vivo. From this work, we learned that polysorbate 20 non-ionic surfactant enhanced gene delivery mediated by niosome formulations into retinal cells in vitro and in vivo. Also, it was shown that nioplexes containing polysorbate 20 entered retinal ARPE-19 cells via caveolae mediated endocytosis in vitro. Moreover, regarding in vivo studies in rat retina, subretinal administration of nioplexes based on polysorbate 20 showed transfection in different layers of the retina, including the retinal pigment epithelium, while intravitreal administration of this formulation showed transfection predominantly in the ganglion cell layer of the retina. The third chapter was designed in order to understand the influence of the genetic material in retinal transfection processes mediated by niosome formulations both in vitro and in vivo. In this study, we learned that niosome formulations containing different DNA constructs presented similar physicochemical characteristics suitable for gene delivery but differed in transfection efficiency in retinal cells. It was shown that MC DNA technology enhanced retinal transfection in vitro as well as in vivo in rat retina. Additionally, stability studies of niosome formulations demonstrated that after 30 days of storage, transfection efficiency of these formulations decreased, specially if stored at room temperature. In vivo studies carried in this chapter also showed that transfection efficiency in different retinal layer depended on the administration route, being the subretinal administration more suitable to transfect the retinal pigment epithelium cell layer and the intravitreal administration better to transfect the ganglion cell layer of the retina. These results are consistent with the previous chapter. Finally, in the fourth chapter of this doctoral thesis, we explored new combinations between niosome-based gene delivery systems and hyaluronic acid hydrogel scaffolds for 3D transfection and local gene delivery. This study was developed during the international predoctoral stay in the Molecular Engineering Department of the University of California in Los Angeles (UCLA). The research developed during that period demonstrated that niosome formulations composed of 2,3-di(tetradecyloxy)propan-1-amine, Poloxamer 407, polysorbate 80 and chloroquine diphosphate salt can be successfully incorporated into hyaluronic acid hydrogels for non-viral gene delivery. Hyaluronic acid hydrogel scaffolds loaded with nioplexes presented suitable mechanical properties, little or no particle aggregation, allowed for extensive cell spreading and were able to efficiently transfect encapsulated mMSCs in 3D cultures. Development and evaluation of non-viral gene delivery vectors and their combination with hydrogel scaffold technology. 4 As a whole, this doctoral thesis describes and explores key factors that determine the transfection efficiency of non-viral vectors and that need to be taken into account when developing efficient non-viral gene delivery systems. Those key aspects include the composition and physicochemical properties of non-viral vectors, the composition and conformation of the genetic material and the combination of delivery systems with other technologies such as matrix design. We believe that the concept of a unique universal non-viral vector is nowadays obsolete, and that future non-viral gene delivery platforms will be based on multifunctional vectors specifically tailored for different applications. Although non-viral vectors are still far from clinical practice, reasonable hope suggests that next generation delivery systems for gene addition and, most importantly, gene editing strategies may be based non-viral vector systems, which, ideally, would be suitable for administration via non-invasive routes.

The current Doctoral Thesis is focused on the development of three-dimensional systems for bone tissue engineering purposes. Gelatin was chosen as the main material to manufacture scaffolds capable for serving as both growth factors delivery carrier and cell-therapy support. The main physic-chemical and biological properties of this natural origin polymer, together with the recent advances in gelatin-based approaches for bone tissue engineering are presented in the Introduction part. In the first experimental work, enzymatic crosslinking of gelatin with microbial transglutaminase enzyme has been optimized and in vitro release of VEGF and BMP-2 were characterized. Biological performance of those formulations was evaluated after cell seeding. In the following study, we reinforced the gelatin-based scaffolds with hydroxyapatite and calcium sulfate. In vitro characterization and in vivo bone regeneration capacity was assessed with osteoporotic mice animal model. Reinforced gelatin systems loaded with BMP-2 promoted successful bone repair in the critical sized defects. Finally, we integrated mineralized gelatin composite and bioinspired anisotropic gelatin hydrogel in a single gradual 3D system, in order to emulate the dissimilar composition, architecture and cellular organization found in the musculoskeletal interfaces. The in vitro biological assessment was performed with human adipose-derived stem cell encapsulated within the 3D biphasic hydrogel.

En la actualidad, las infecciones causadas por Streptococcus pneumoniae y por Haemophilus influenzae mantienen una alta prevalencia. Las formas de infección invasivas de estas enfermedades suponen cuadros graves como la neumonía bacteriémica, septicemia y meningitis, entre otras, mientras que las infecciones no invasivas son manifestaciones más frecuentes y menos graves, como la sinusitis, otitis media aguda (OMA) y neumonía comunitaria no bacteriémica. La principal estrategia de prevención de estas enfermedades es la vacunación. Sin embargo, una de las consecuencias de la implantación de los programas de vacunación es el cambio en la epidemiología de los microorganismos responsables de las infecciones, que se manifiesta por variaciones en la frecuencia relativa de los diferentes serotipos o reemplazos de los mismos, y por cambios en el perfil de sensibilidad a los antimicrobianos. El seguimiento de estos cambios es esencial para la implantación de nuevas vacunas y para el control de las resistencias. Además, tiene una gran importancia en las decisiones clínicas sobre la selección de los tratamientos antimicrobianos empíricos más adecuados. En este sentido, el análisis farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD) ha demostrado ser una herramienta muy útil con la que se puede evaluar el cambio de la actividad antimicrobiana frente a los aislados clínicos, siendo complementaria a los estudios de sensibilidad basados únicamente en la evolución de la distribución de los valores de concentración mínima inhibitoria (CMI). El objetivo general de esta Tesis Doctoral es la aplicación del análisis PK/PD y la simulación de Montecarlo en la evaluación de la antibioterapia utilizada en el tratamiento de infecciones invasivas y no invasivas debidas a Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae. El tratamiento empírico de elección de la otitis media aguda (OMA) en niños es amoxicilina a dosis altas (30 mg/kg q8 o 33 mg/kg q8). Si existiera sospecha de que H. influenzae está involucrado en el proceso infeccioso, el tratamiento más adecuado sería amoxicilina/clavulánico a dosis iguales o superiores a 40 mg/kg/día. En el tratamiento de las infecciones invasivas por H. influenzae con amoxicilina y ampicilina, la producción de beta-lactamasas es un factor limitante del éxito de la terapia. Si no se dispone de esta información, amoxicilina/clavulánico, ceftriaxona, cefotaxima, imipenem y ciprofloxacino serían adecuados, independientemente del régimen de dosificación y del mecanismo de resistencia. Cefotaxima 2 g q 6h y ceftriaxona 4 g/día son adecuados para el tratamiento de meningitis por H. influenzae. Bencilpenicilina y cefotaxima son opciones adecuadas para el tratamiento empírico de la enfermedad neumocócica invasiva (ENI). Bencilpenicilina 4 mU q 4h y cefotaxima 2 g q 6h podrían utilizarse incluso para el tratamiento de meningitis por S. pneumoniae. En conclusión, el análisis PK/PD resulta de utilidad para evaluar la idoneidad del tratamiento antimicrobiano de las infecciones debidas a H. influenzae y S. pneumoniae, y por tanto podría incluirse en los procedimientos de vigilancia epidemiológica tras la implantación de programas de vacunación.

Introduction: Augmented renal clearance (ARC) is a phenomenon recently identified in critically ill patients. ARC has the potential to influence the pharmacokinetic profile of any drug that is renally cleared and known to have a direct correlation between renal clearance (CL) and creatinine clearance (CrCl), such as levetiracetam. Objective: The aim of this thesis was initially to evaluate the adequacy of levetiracetam dosing for the achievement of therapeutic levels in patients with normal or high renal clearance admitted to the ICU by the characterization of its pharmacokinetics by population modelling and simulation. Alternative dosage regimens able to achieve target concentrations in this population have been also proposed using stochastic simulations and considering biopharmaceutical and pharmacokinetic aspects. Methods: A systematic review on ARC phenomenon was conducted. A multicentre prospective study in critically ill patients treated with levetiracetam was carried out. A population pharmacokinetic model of levetiracetam in critically ill patients was developed. Alternative dosage regimens were evaluated by Monte Carlo simulation. Results and discussion: The systematic review showed that ARC, defined as a CrCl >130 mL/min/1.73 m2 measured in urine, is present in 20 to 65% of critically ill patients, being younger age, polytrauma and lower severity illness identified risk factors. Twenty-seven critically ill patients were included in the pharmacokinetic study. A two-compartment model best described levetiracetam pharmacokinetics in this population, only CrCl was found to be a significant covariate of its CL. In critically ill patients with ARC conventional dosage regimens (500-1500 mg twice daily in a short infusion) do not allow to obtain trough plasma concentrations in the defined target, between 12 and 46mg/L. New dosage regimens to be implemented in critically ill patients with ARC were proposed by using Monte Carlo simulations based on the population pharmacokinetic model developed and considering biopharmaceutical and pharmacokinetics aspects.

Mesenchymal stromal cells (MSCs) present the ability to secrete important immunomodulatory factors, and therefore, hold great potential for the treatment of multiple inflammatory and immune disorders. However, for the success of MSC-based therapies, the optimization of administration protocols is fundamental. In such regard, three-dimensional (3D) cell encapsulation emerges as a valuable strategy for MSC administration, since it overcomes the important hurdles of nude cell administration and represents a versatile platform to mimic the natural niche of cells. In the present doctoral thesis, we focused on the design of a multifunctional system consisting of a hydrogel incorporating alginate-poly-L-lysine-alginate (APA) microencapsulated MSCs, an adequate biofunctionalization strategy and the continuous presence of interferon-¿ (IFN-¿), hypothesizing that it would represent an integrated solution to (1) protect MSCs from the host immune system, (2) to promote their viability and (3) to boost their immunomodulatory properties. Therefore, here, we studied in depth and optimized each one of the three main elements. In particular, we established a tight control on APA-microencapsulated MSC behavior enhancing the biosafety of the therapy, we designed a biosensor that provides essential information about the specific MSC biofunctionalization requirements and we developed a strategy to boost the immunomodulatory properties of MSCs based on the inclusion of IFN-¿ and the 3D cell culture itself. These data represent an important step forward in the development of cell encapsulation systems, having significant implications in MSC therapies.

El objetivo de esta tesis es analizar los factores que influyen en el gasto farmacéutico de los médicos de los centros de salud de atención primaria de la Comarca Araba y evaluar su relación con los indicadores de calidad de la prescripción. Los datos se han extraído a partir de las recetas prescritas por los 200 médicos de familia de la Comarca Araba y dispensadas por las oficinas de farmacia entre los años 2009 y 2014. Las variables evaluadas corresponden a los indicadores de calidad de la prescripción farmacéutica recogidos en el Contrato-Programa del Dpto. de Salud: prescripción de medicamentos genéricos, medicamentos novedosos, antibióticos, analgésicos, hipolipemiantes, antidepresivos, antiulcerosos, medicamentos para osteoporosis y medicamentos de la Guía Farmacoterapéutica de Osakidetza y su relación con los factores profesionales: edad, sexo, docencia, ámbito rural o urbano, estabilidad laboral y antigüedad en la plaza médica. Como resultados más destacables hemos encontrado los siguientes: - No se han observado diferencias en el gasto farmacéutico por persona en función del sexo y la edad de los facultativos y tampoco si el ámbito de su trabajo es rural o urbano. - Los médicos de los centros de salud con docencia a médicos residentes tienen mejores indicadores de calidad de prescripción. - Los médicos que llevan más tiempo trabajando tienen peores indicadores de calidad y prescriben menos medicamentos de primera elección en atención primaria. - Los factores que más influyen en el gasto farmacéutico son el elevado porcentaje de pensionistas en el cupo médico, el uso de medicamentos novedosos y la prescripción de estatinas y de antiulcerosos inhibidores de la bomba de protones. - Los médicos con mayor gasto farmacéutico por persona tienen peores indicadores de calidad de la prescripción.

Esta tesis doctoral nace del interés de BIOSASUN en el desarrollo de formulaciones novedosas como solución a las limitaciones que presentan los polifenoles del olivo. Ello, unido a la especialidad del Grupo Nanobiocel en el diseño de nanoformulaciones ha dado lugar al desarrollo de varios trabajos centrados en la aplicación de los principios de la nanociencia verde para el desarrollo de nanopartículas lipídicas que permitan encapsular y controlar la liberación de polifenoles del olivo de forma eficaz en el lugar de acción deseado. El enfoque del trabajo ha sido desde una perspectiva de Ciencia Verde, hacia un fomento de la economía circular en la industria oleica. Por ello se han diseñado nanopartículas lipídicas con acidos grasos y triglicéridos que pueden obtenerse del propio olivo, y el principio activo a encapsular (oleuropeína) se ha extraído de una forma sostenible a partir de hojas de olivos ecológicos que consituyen, de hecho, un sub-producto importante en la industria del aceite de oliva. Bajo este prisma, se ha desarrollado y validado una técnica anatíca de cromatografía para la caracterización de las materias primas y la nanoformualción, todo ello siguiendo los principios establecidos de la Química Verde. A continuación, se ha desarrollado y caracterizado la nanoformulación que sirve para encapsular el polifenol de olivo seleccionado. El proceso de nanoformulación ha sido diseñado para evitar el uso de solventes orgánicos y se ha caracterizado tanto la eficiencia del proceso como la no-toxicidad de la formulación en células epiteliales. Por último, se ha evaluado la eficacia de la formulación desarrollada in vitro en modelos de inflamación y de estrés oxidativo, así como en un modelo in vivo de colitis ulcerosa que cursa tanto como con procesos inflamatorios como de estrés oxidativo.

El objetivo principal de esta tesis se ha centrado en evaluar el impacto de la intervención del farmacéutico comunitario en la mejora de la adherencia terapéutica, y en concreto en los tratamientos hipolipemiantes, así como en la detección de discrepancias en el uso de medicamentos. Se han llevado a cabo los siguientes estudios: (i) estudio randomizado, controlado y multicéntrico donde se analiza el impacto de la intervención profesional en la falta de adherencia en pacientes con prescripción de estatinas y su relación con las variables clínicas y las causas de la falta de adherencia; (ii) revisión sistemática que contextualiza y actualiza la evidencia científica sobre las intervenciones del farmacéutico comunitario para mejorar la adherencia a tratamientos hipolipemiantes y su relación con las variables clínicas y (iii) estudio experimental que analiza el impacto de un servicio profesional farmacéutico asistencial para detectar y resolver discrepancias entre la medicación prescrita a los pacientes y la hoja de tratamiento activo. Se concluye que la intervención del farmacéutico comunitario mejora la adherencia en pacientes al tratamiento con estatinas. Por otra parte, el servicio de detección de discrepancias en el uso de medicamentos presenta un resultado de coste-efectividad positivo.

La medicina regenerativa definida como ¿un área interdisciplinar de la medicina dirigida a la reparación, reposición o regeneración de células, tejidos u órganos dañados estructural o funcionalmente¿, se postula como un campo emergente con la capacidad de aportar soluciones eficaces que mejoren la calidad de vida de los pacientes. Una de las líneas de investigación más prometedoras, es la basada en el potencial regenerativo del plasma rico en plaquetas. Esta tecnología deriva de la extracción de un pequeño volumen de sangre del paciente que es centrifugada y procesada in situ para obtener un concentrado plaquetario capaz de dar lugar a diferentes formulaciones farmacéuticas enriquecidas en factores de crecimiento y proteínas bioactivas. La tecnología del plasma rico en factores crecimiento (PRGF), un preparado especial de plasma rico en plaquetas, puede suponer un punto de partida que ofrezca un nuevo enfoque biológico dirigido a tratar diversas afecciones cutáneas desde una perspectiva autóloga. En el presente trabajo de investigación se pretende aislar y caracterizar diferentes líneas de fibroblastos dérmicos a modo de sistema experimental sobre los que testar y poner a punto el PRGF como suplemento de cultivo celular. Además, se realizará una caracterización hematológica y proteica del PRGF obtenido de una población heterogénea de donantes y se analizarán sus mecanismos biológicos a nivel celular. A modo de condición patológica cutánea recurrente, también se estudiará el potencial terapéutico de los factores de crecimiento autólogos en situaciones de estrés oxidativo tanto in vitro como en modelos de piel 3D humana. Finalmente, se profundizará en la versatilidad de la tecnología PRGF con el fin de desarrollar nuevas formulaciones farmacéuticas derivadas de la sangre del paciente. En resumen, se pretende estudiar y evaluar el PRGF como una nueva herramienta terapéutica en dermatología regenerativa.

La tecnología de plasma rico en factores de crecimiento, PRGF (por sus siglas en inglés, Plasma Rich in Growth Factors) es una terapia biológica autóloga que utiliza los propios componentes de la sangre del paciente como agentes terapéuticos para promover la reparación y regeneración de los tejidos dañados. Su eficacia y seguridad ha sido comprobada durante más de veinte años tanto en investigación preclínica como clínica. EL PRGF se obtiene partiendo de un pequeño volumen de sangre del paciente. Posteriormente, mediante un proceso de centrifugación y fraccionamiento, se selecciona el plasma enriquecido en plaquetas y se descartan los leucocitos y eritrocitos. A partir del plasma enriquecido en plaquetas en forma líquida, y controlando la activación, tanto de las plaquetas como de la cascada de coagulación, se pueden generar múltiples formulaciones: PRGF líquido recién activado, con capacidad de polimerizar in situ, sobrenadante de PRGF, coágulo o matriz, y membrana de fibrina. Cada una de ellas posee unas características intrínsecas fundamentales para su aplicación en lesiones concretas. En todos los casos son formulaciones que están diseñadas para optimizar y acelerar la regeneración tisular. EL PRGF actúa como un efectivo agente terapéutico, basándose para su aplicación en los principios de la medicina personalizada, la ingeniería de tejidos y en procedimientos mínimamente invasivos. La tecnología PRGF ha sido caracterizada en múltiples investigaciones preclínicas, siempre siguiendo los pilares de la investigación científica, y siempre en aras de garantizar la seguridad de los productos aplicados. Esta tesis es el resultado de tres estudios preclínicos in vitro de caracterización y optimización del PRGF. En ellos se ha realizado una caracterización proteómica de alto rendimiento de las proteínas que quedan retenidas y adheridas a la matriz o scaffold de fibrina de PRGF. Seguidamente se puso el foco en el conjunto de moléculas liberadas a partir de la matriz de fibrina, determinándose la cinética de liberación de distintos morfógenos de la matriz de PRGF. De forma simultánea se profundizó en los mecanismos moleculares ligados a la eficacia del PRGF y en especial en el papel que los leucocitos pueden jugar en la composición del PRGF. El siguiente paso fue optimizar el protocolo de obtención del PRGF, reduciendo los niveles de anticoagulante y activador, con el fin de realizar un protocolo más fisiológico. Finalmente, se realizó análisis teórico de diferentes aspectos relacionados con el plasma rico en plaquetas (PRP) y que son esenciales para lograr un avance en la utilización segura y eficaz de este tipo de terapias. Fruto de la evolución del marco regulatorio y de la propia tecnología se realiza un análisis detallado de varios aspectos clave, como son el marco regulatorio del plasma rico en plaquetas (PRP), su aplicación alogénica y la estandarización de este tipo de terapias biológicas. Se profundizará en estos temas sobre la base de una serie de tres artículos científicos de perspectiva.

El envejecimiento global de la población está aumentando de manera acelerada. Estos cambios demográficos conllevan un aumento en la prevalencia de enfermedades crónicas y degenerativas relacionadas con la edad y asociadas a un incremento en la ingesta de medicamentos. En la medida en que las necesidades sociales y sanitarias de la sociedad varían, la presión por desarrollar nuevas alternativas aumenta. En los últimos años, el creciente conocimiento de los procesos biológicos implicados en la regeneración tisular ha favorecido el camino para desarrollar nuevas terapias con el objetivo final de promover y acelerar dicha regeneración. En este contexto, la medicina personalizada está emergiendo como una opción terapéutica prometedora que se basa en la compleja singularidad de cada paciente ofreciendo tratamientos a medida. La compleja estructura del periodonto y la interacción estructural de múltiples tejidos blandos y duros convierte a la regeneración periodontal en un proceso único. Las enfermedades periodontales se caracterizan por afectar a la composición e integridad de todas esas estructuras involucradas en el periodonto cuyo funcionamiento sólo se alcanza mediante la integración estructural de todos sus componentes. La periodontitis está considerada como la condición inflamatoria crónica más común en los humanos, cuya prevalencia aumenta con la edad. La carga mundial como consecuencia de la morbilidad, costes e impacto socioeconómico es notoriamente elevada. Por el contrario, la patología de la osteonecrosis de los maxilares inducida por bifosfonatos (BRONJ) es relativamente poco común, sin embargo, presenta importantes repercusiones tanto para la calidad de vida del paciente como para los recursos médicos. El tratamiento terapéutico para estas patologías sigue siendo controvertido y aún no se ha establecido una terapia estándar para estas enfermedades. Teniendo en cuenta las actuales limitaciones de los enfoques terapéuticos disponibles, los esfuerzos en investigación se están dirigiendo hacia la ingeniería de tejidos. Este enfoque alternativo, se centra en superar las deficiencias de las modalidades de tratamiento convencionales para restaurar la arquitectura y funcionalidad originales. El uso efectivo y pertinente de la ingeniería de tejidos requiere la integración de tres componentes esenciales: una población de células progenitoras multipotentes, moléculas de señalización y matrices biocompatibles [8]. En este sentido, la terapia con células madre representa una herramienta emergente y prometedora por su gran potencial terapéutico en la medicina regenerativa. Las células madre de pulpa dental se obtienen mediante métodos de aislamiento no invasivos, representando así una fuente valiosa de fácil acceso y con propiedades biológicas especiales de células madre mesenquimales y células madre de la cresta neural. Dado que la cantidad de células madre presentes en un determinado tejido es reducida, se requiere una expansión ex vivo para producir una dosis adecuada con el fin de lograr resultados terapéuticos. El suero bovino fetal se ha utilizado durante mucho tiempo como un suplemento de cultivo celular estándar ampliamente aceptado tanto para investigación como para uso clínico. Sin embargo, cuestiones como la limitada disponibilidad, el riesgo de contaminación por patógenos, los problemas éticos relacionados con el bienestar animal o la inducción de reacciones inmunológicas en el huésped, han llevado a explorar otras alternativas para proporcionar productos de terapia celular seguros, regulados y efectivos para los pacientes. Actualmente, se están explorando numerosos productos autólogos derivados de la sangre humana como posibles alternativas al uso del suero bovino fetal. En los últimos años, los derivados plaquetarios han surgido como nuevas herramientas para ser utilizadas por sus propiedades en la reparación tisular. En este sentido, la tecnología del plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) es pionera en el uso autólogo de factores de crecimiento, proteínas y biomateriales derivados del plasma y de las plaquetas con fines curativos. La versatilidad de esta tecnología le ha permitido ser aplicada con seguridad y eficacia en diferentes campos de la biomedicina (ortopedia, oftalmología, cirugía oral y maxilofacial y dermatología), así como alternativa al uso de productos xenogénicos en la expansión celular ex vivo. Por todo ello, mediante esta tesis se pretende realizar un trabajo de investigación que evalúe in vitro el potencial terapéutico de la tecnología autóloga PRGF en el tratamiento de dos patologías orales: periodontitis y BRONJ, y su aplicabilidad en terapias celulares, con objeto de estimular la regeneración tisular.

El eje central de esta tesis doctoral consiste en la búsqueda del conjunto de técnicas más adecuadas para la obtención de células productoras de insulina diferenciadas a partir de células mesenquimales en el interior de microcápsulas, cuya composición se habrá optimizado para recrear el ambiente de estos tipos celulares con la mayor fidelidad posible. Para ello, se han llevado a cabo los siguientes estudios: (I) Obtención de un biomaterial compuesto de alginato y ácido hialurónico apto para microencapsulación con similares propiedades físicas y químicas a las microcápsulas de alginato. (II) Estudios in vitro con células encapsuladas para comprobar que el biomaterial recrea el ambiente in vivo de las células mesenquimales. (III) Comparativa del comportamiento biológico de células productoras de insulina encapsuladas en matrices de alginato y alginato-hialurónico. (IV) Diferenciación de células mesenquimales procedentes de distintos tejidos encapsuladas en mezclas de alginato y alginato-hialurónico para la obtención de células ß productoras de insulina.

El proceso inflamatorio de la superficie ocular subyace en la base de importantes enfermedades que pueden provocar incluso la pérdida de la visión en los casos más graves. Actualmente, la terapia de elección de la inflamación corneal o keratitis, además de presentar eficacia limitada, conlleva importantes efectos adversos. La interleuquina-10 (IL-10) juega un papel fundamental en la resolución de la inflamación corneal, pero su aplicación terapéutica es inviable debido a su corta semivida de eliminación y baja biodisponibilidad ocular. La terapia génica representa una nueva estrategia terapéutica, mediante la que se podría abordar el tratamiento de la queratitis de una manera efectiva y segura induciendo la producción de IL-10 en la córnea. En este sentido, las nanopartículas sólidas lipídicas (SLNs) son uno de los sistemas más prometedores tanto para la administración ocular de fármacos como para la preparación de vectores no virales para terapia génica. El objetivo de la presente tesis doctoral fue el diseño, desarrollo y evaluación in vitro, ex vivo e in vivo de vectores no virales basados en SLNs para el tratamiento de la inflamación corneal mediante terapia génica. Los sistemas se formularon en forma de colirio para inducir la producción de novo de la potente citoquina antiinflamatoria IL-10 en las células corneales, tras su administración por vía tópica. Se diseñaron y caracterizaron vectores formados por diferentes SLNs combinadas con ligandos, como protamina y polisacáridos. Se evaluaron in vitro en células humanas de epitelio corneal (HCE-2) y en un modelo ex vivo de córnea de conejo. Los vectores más eficaces se formularon en forma de colirio empleando como agente viscosizante alcohol polivinílico. Tras la caracterización de las formulaciones y la determinación de su capacidad de transfección y penetración corneal in vivo, se evaluó la capacidad para inducir la expresión de IL-10 en las diferentes células corneales en ratones wild type y knock out para IL- 10, tras su administración tópica.

La resistencia a los antibióticos (AMR) es un problema grave que debe abordarse lo antes posible. La colistina y la amikacina representan unos de los pocos antibióticos eficaces contra las infecciones de las bacterias gran-negativas multirresistentes, pero son altamente neuro y nefrotóxicos. De hecho, los médicos se ven obligados a elegir entre una dosis efectiva o segura, lo cual conduce mayoritariamente al fracaso del tratamiento. Teniendo eso en cuenta, los transportadores lipídicos nanoestructurados (NLCs) representan una estrategia cautivadora para reducir la toxicidad del fármaco, capaz de liberar antibióticos de manera sostenida y permitir la reducción de la dosis. En esta tesis doctoral, se han desarrollado, caracterizado y analizado las NLCs cargadas con colistina en modelos de neumonía en ratones con resultados prometedores, logrando una reducción significativa de la dosis, una mayor eficacia y una posible reducción de la toxicidad. Además, se probó la seguridad de la NLCs vacías aplicada tópicamente en piel intacta y dañada. Las NLCs resultaron ser seguras y podrían ejercer un efecto local sobre las heridas infectadas, lo cual representa una gran oportunidad a explotar en un futuro cercano. En esencia, los NLC podrían ser la más segura estrategia para el suministro de antibióticos en infecciones multiresistentes del tracto respiratorios y de heridas.

La presente tesis doctoral está centrada en la mejora de las tecnologías de micro- y macroencapsulación celular basadas en alginato para su aplicación en el trasplante de células ß como tratamiento de la Diabetes Mellitus de tipo 1. Por un lado, la microencapsulación celular presenta una limitación técnica que impide su aplicación en la clínica, la cual reside en el gran volumen de microcápsulas necesario para obtener un efecto terapéutico. Esto es debido a la elevada cantidad de microcápsulas vacías que se generan durante el proceso de formación de las microcápsulas. Por otro lado, la macroencapsulación se ve limitada por el bajo control sobre el proceso de gelificación de los hidrogeles de alginato, lo que afecta drásticamente a su inyectabilidad cuando se quieren implantar mediante una inyección, o bien se quieren introducir en un dispositivo implantable. Además, los hidrogeles son frágiles y no pueden asegurar la supervivencia de las células ß a largo plazo. Para solventar estas dificultades y acercar a la clínica estas tecnologías, se han llevado a cabo los siguientes estudios: 1) Desarrollo de un sistema de purificación de microcápsulas con el objetivo de reducir el volumen terapéutico de células ß encapsuladas. 2) Modulación de las propiedades fisicoquímicas de los hidrogeles de alginato con el objetivo de controlar el proceso gelificación para mejorar la inyectabilidad sin afectar la elevada biocompatibilidad de este biomaterial para células ß. 3) Desarrollo de un dispositivo de macroencapsulación biocompatible para proteger y estabilizar los hidrogeles de alginato desarrollados en el punto 2), y de esta manera aumentar la supervivencia de las células ß.

Neurodegenerative diseases (NDs) are an accelerating global problem, but we still lack routes to develop effective therapeutics. In this quest, it is crucial to identify novel drug candidates or drug carriers, which cross the blood-brain barrier (BBB) and reach the brain tissue. In the present doctoral thesis, we have focused on nanostructured lipid carriers (NLCs) development for the targeted delivery of NTFs. The NLCs surface modification with chitosan (CS) and TAT effectively deliver glial derived neurotrophic factor (GDNF) NTF in Parkinson Disease (PD) animal model, restoring its motor activity and modulation of the reactive gliosis. Moreover, the chronic administration of ¿-3 fatty acids to PD animal model led to animals¿ dopaminergic system improvement, and modulate the present neuroinflammation and oxidative stress. As a following step, the tested functional lipids were used to NLC development, retaining their ability as neuroprotective and anti-inflammatory agents. Finally, the compose NLCs with ¿-3 functional lipids and surface modified with TAT and CS tested positive to pass across human BBB in vitro model, showing as a good candidate to target the brain. The anti-inflammatory and anti-oxidative potential of these ¿-3 nanocarriers successfully counteracted the inflammatory state present in human microglia cell line. The co administration with glial derived neurotrophic factor (GDNF) triggered the endogenous anti-oxidative system present in microglia. All these data support the development of NLC composed of functional lipids, and surface modified with different moieties, to target and treat CNS related disorders.

In recent years, organ transplantation technology has made significant improvements regarding long-term survival, substantially decreasing the risk of graft rejection. However, with each passing year, the gap between available donors and the number of patients needing an organ transplant is steadily increasing. Consequently, there is a growing demand to create engineered tissues to minimize the need for organ transplantation. However, the rejection of engineered tissue implants has become a critical challenge today. Primarily, rejection occurs due to the crosstalk between immune cells, such as macrophages, and the engineered tissue structure. Therefore, it is important to be able to influence the immune cell milieu of the implantation site to achieve graft integration. With this perspective in mind, this doctoral thesis aimed to provide two different strategies: The first one is the use of human hair follicle derived mesenchymal stromal cells (HF-MSCs) for immunomodulation. For that, we isolate and characterize MSCs from human hair follicles and then, we analyzed the immunomodulatory capacity of the cells by means of the inhibition of peripheral mononuclear cells (PBMCs), inducing T regulatory phenotype and skewing macrophages towards a tissue remodeling phenotype (aka M2). The second strategy relied on the application of tissue-engineered blood vessels to interact with different macrophage phenotypes and thus promoting a tissue remodeling response around the implant. The effects of blood vessels on undifferentiated (M0), pro-inflammatory (M1) and regenerative (M2 and M1M2) macrophage phenotypical change were assessed by single cell analysis, specifically using dimensionality reduction and clustering algorithms for a thorough characterization of resulted macrophage phenotype. Therefore, we could conclude that both strategies could have an important developmental impact towards the implementation of immunomodulatory techniques and could have important consequences for tissue engineering.

En esta tesis elaboramos y caracterizamos una nueva formulación de niosomas no virales (DP60L) basada en lípidos catiónicos DOTMA y polisorbato 60 como tensioactivo no iónico y licopeno como lípido auxiliar. Los nuevos niosomas presentaron propiedades fisicoquímicas adecuadas para aplicaciones de administración de genes en términos de tamaño, carga superficial, polidispersidad o capacidad para proteger el material genético contra la digestión enzimática. La incorporación de un compuesto natural como el licopeno en la formulación aumentó la eficiencia de transfección en las células ARPE-19, sin afectar la viabilidad celular, probablemente debido a la vía de endocitosis particular que evadió la degradación lisosómica del ADN. Las administraciones in vivo de nioplexos DP60L a la retina de rata transfectó las capas celulares externas de la retina, lo que ofrece una esperanza razonable para el tratamiento de muchas enfermedades retinianas heredadas mediante una formulación no viral segura. Por otro lado, dicha formulación fue capaz de transfectar eficientemente las células NT2 mostrando propiedades de escape endosómico que podrían explicar los altos niveles de expresión de proteínas observados. Se obtuvieron resultados prometedores en cultivos corticales primarios de embriones de rata e in vivo después de la inyección intracraneal, reforzando la aplicación futura de dichos niosomas como herramienta eficiente de entrega de genes para el tratamiento de los trastornos degenerativos y malignos del SNC. Finalmente, la adición de otra molécula auxiliar, como la cloroquina, mejoró la transfección retiniana in vivo tras adminsitración intravitrea y subretiniana.

En la tesis actual, demostramos que los nioplexos DP80 podían transfectar eficientemente células mesenquimales MSC D1 con los plásmidos pCMS-EGFP y pUNO1-hBMP7. Sin embargo, se requiere la optimización del proceso de formulación de niosomas para mejorar la eficacia de la transfección y la viabilidad celular. Además, las células D1-MSC transfectadas con hBMP7 podrían considerarse no solo como una herramienta eficaz de administración de la proteína hBMP7, sino también como células proliferantes y regeneradoras de hueso con fines terapéuticos, ofreciendo una esperanza razonable de utilizar esta doble estrategia basada en terapia génica mediante vectores no virales y celular mediante la administración de células mesenquimales para la regeneración ósea. Por otro lado, nuestros resultados mostraron que los niosomas DPP80, elaborados con una mezcla de tensioactivos no iónicos P y P80, fueron capaces de transfectar eficientemente las células NT2 sin comprometer su viabilidad. Los complejos DPP80-EGFP pudieron transfectar preferentemente neuronas en cultivos corticales primarios embrionarios de rata e inducir la transfección directa in vivo de células gliales en la corteza cerebral de rata. Finalmente, proporcionamos una prueba de concepto de que las células NT2 podrían transfectarse con plásmidos de expresión hBMP7 usando como vector no viral los niosomas catiónicos DPP80. Las células NT2 que sobreexpresaron hBMP7 podrían dificultar la migración de las células de glioma C6. Estos resultados destacan el potencial de esta estrategia para impedir la metástasis de las células de glioma.

El alginato es uno de los mejores biomateriales para la preparación de estos hidrogeles debido a sus excelentes propiedades, entre ellas su alta biocompatibilidad y facilidad de gelificación. Los hidrogeles de alginato han sido particularmente efectivos en la curación de heridas, administración de fármacos, terapias basadas en células y aplicaciones de ingeniería de tejidos. Estos hidrogeles a base de alginato conservan una estructura similar a las matrices extracelulares. Sin embargo, los hidrogeles de alginato tienen una adhesión celular deficiente, una resistencia mecánica débil y una liberación rápida del fármaco. Para compensar este inconveniente, muchos investigadores han incorporado diferentes materiales en la matriz de alginato para proporcionar soporte biomimético. El grafeno y sus derivados (óxido de grafeno y óxido de grafeno reducido) han demostrado ser candidatos adecuados para mejorar las propiedades superficiales y la resistencia mecánica del alginate. Anteriormente observamos que GO, recubierto con suero bovino fetal (FBS) dentro de hidrogeles de alginato, mejora la viabilidad de los mioblastos incrustados. En la investigación actual, nuestro objetivo es estudiar varias proteínas, específicamente albúmina sérica bovina (BSA), colágeno tipo I y elastina, para discernir su impacto en la mejora observada previamente en mioblastos incrustados dentro de hidrogeles de alginato que contienen GO recubierto con FBS. Por lo tanto, describimos los mecanismos de formación de capas de proteína BSA, colágeno y elastina en la superficie GO y rGO. GO muestra una alta adsorción por BSA y elastina, mientras que rGO muestra una alta adsorción por colágeno. encontramos que la integración de GO y rGO disminuye la impedancia y la capacitancia de GO y rGO. Además, describimos una mejor viabilidad celular y liberación de proteínas de las células incrustadas dentro de hidrogeles que contienen GO recubierto de proteínas. Concluimos que estos hidrogeles híbridos podrían suponer un paso adelante en la medicina regenerative.

El objetivo de esta tesis es comparar la efectividad, seguridad y eficiencia de los nuevos anticoagulantes orales (dabigatran, apixaban y rivaroxaban- NACO) frente a acenocumarol en los pacientes con fibrilación auricular que comienzan tratamiento con alguno de estos fármacos. Se seleccionan 10.843 nuevos usuarios de estos fármacos entre 2013 y 2016 en la CAPV y seguidos hasta diciembre de 2019. Se realizan análisis de efectividad comparada y análisis de supervivencia ajustada mediante técnicas de propensity score, ponderación por el inverso de la probabilidad de tratamiento y gradient boosting machine. Los NACO presentan una efectividad similar a acenocumarol en cuanto al riesgo de aparición de ictus o eventos tromboembólicos; el riesgo de hemorragias severas es menor con el empleo de un NACO, aunque los resultados no sean totalmente concluyentes. El uso de los NACO comparado con acenocumarol es coste-efectivo para una disponibilidad a pagar de 20.000 ¿/Año de Vida Ganado. Esta eficiencia se confirma empleando las distintas técnicas de ajuste mencionadas. El elevado tamaño muestral, una media de seguimiento de los pacientes superior a los 4 años, y la utilización de técnicas adecuadas para el análisis de datos de vida real (RWD) son aspectos novedosos que sobre este tema aporta esta tesis.

La sepsis grave sigue siendo una importante causa de morbi-mortalidad en las unidades de cuidados intensivos. La piedra angular del tratamiento de la infección es el inicio precoz de un tratamiento antibiótico adecuado y el control del foco infeccioso. Además, para optimizar la antibioterapia hay que seleccionar no sólo el antimicrobiano más adecuado, sino que debemos seleccionar el régimen de dosificación óptimo, teniendo en cuenta los índices farmacocinéticos/farmacodinámicos (PK/PD) que mejor se correlacionan con la eficacia y cómo las alteraciones fisiopatológicas que se pueden producir en los pacientes críticos pueden alterar sus propiedades farmacocinéticas. Linezolid es un antibiótico del grupo de las oxazolidinonas, útil como alternativa a la vancomicina para el tratamiento de microorganismos Gram-positivos. Su PK presenta una gran variabilidad interindividual. En pacientes críticos su aclaramiento puede ser superior a lo descrito en individuos sanos, estando en riesgo de alcanzar niveles sub terapéuticos. Por otro lado, en pacientes sometidos a técnicas continuas de reemplazo renal (TCRR), no parece existir aún consenso respecto a si la dosificación actual es adecuada o no, sugiriendo la utilidad de la monitorización de niveles. Por todo ello hemos llevado a cabo un estudio cuyo objetivo principal ha sido caracterizar la farmacocinética de linezolid en diferentes grupos de pacientes críticos, y evaluar si el régimen de dosificación es adecuado o no de acuerdo a criterios PK/PD utilizando la Simulación de Montecarlo (SMC) como herramienta. En una primera parte del estudio evaluamos la PK de linezolid en pacientes sometidos a TCRR, y si la función renal residual del paciente podía tener influencia en la probabilidad de alcanzar el objetivo PD. Se incluyeron 21 pacientes críticos sépticos que precisaron TCRR por diferentes grados de disfunción renal. Además de confirmarse la alta variabilidad interindividual en la farmacocinética de linezolid en pacientes críticos pudimos observar como en pacientes con fracaso renal tratados con TCRR, la presencia de función renal residual, definida como un CLCr >10 mL/min, condiciona un aclaramiento total de linezolid significativamente más alto que en pacientes anúricos. En pacientes anúricos, la dosis recomendada proporciona una probabilidad moderadamente alta de éxito si la infección es debida a microorganismos con CMI¿2 mg/L. Sin embargo, en pacientes con función renal residual, la dosis estándar puede ser insuficiente. Una dosis de 900 mg cada 8 horas incrementa notablemente la probabilidad de éxito sin comprometer la seguridad. En un segundo estudio evaluamos la PK de linezolid en 17 pacientes críticos con diferentes grados de funcionalidad renal, incluyendo pacientes con aclaramiento renal aumentado (ARC). El análisis PK/PD mostró que, en ausencia de ARC, la dosis estándar proporciona una probabilidad de éxito moderada para valores de CMI de 2 mg/L. Además, con la SMC se demuestra que la administración en forma de perfusión continua permitiría cubrir hasta CMIs de 4 mg/L. Sin embargo, si el paciente presenta ARC, con la dosis estándar, hay un riesgo elevado de infradosificación. Para estos pacientes, una dosis mayor de linezolid y administrada en forma de perfusión continua (75 mg/h) podría ser una mejor opción que la dosis estándar administrada en perfusión intermitente. Para confirmar si la administración de linezolid en perfusión continua es capaz de proporcionar mejores índices de eficacia, realizamos un tercer estudio en el que incluimos 26 pacientes con y sin ARC a los que se les administró linezolid en forma de infusión continua de 50 mg/h. En conjunto, la mayoría de los pacientes presentó niveles ¿ 2 mg/L, aunque el porcentaje de pacientes fue mayor en el grupo sin ARC (94 vs 70%). Pudimos observar que la administración linezolid en perfusión continua, especialmente la dosis de 75 mg/h, puede ser una alternativa adecuada para tratar de forma empírica a pacientes con altos valores de aclaramiento de creatinina. La monitorización de niveles de linezolid para optimizar el tratamiento con este antibiótico ha sido recomendada por numerosos autores. La monitorización diaria del aclaramiento de creatinina basado en la medida de creatinina en orina para detectar la presencia de ARC permitiría ajustar la posología y evitar el riesgo de infradosificación. Finalmente, la monitorización de niveles en sangre podría ser una estrategia útil para optimizar la dosificación de linezolid, especialmente en pacientes con riesgo de infradosificación y/o toxicidad.

En la presente tesis doctoral se abordan aspectos relacionados con la biocompatibilidad y bioseguridad de los sistemas de microencapsulación celular para la liberación sostenida de moléculas terapéuticas. En una primera parte, se analizó el comportamiento de una línea de células madre mesenquimales D1 (D1-MSC), genéticamente modificadas para secretar eritropoyetina (EPO), dentro de dichos sistemas. Para ello, se realizaron pruebas de viabilidad y metabolismo celular, proliferación y secreción de la molécula activa, durante 45 días, tanto in vitro como in vivo, en un modelo de ratón. El estudio incluyó 4 grupos de microcápsulas con diferentes cargas celulares, de forma que fue posible evaluar la influencia de dicho parámetro en el comportamiento final de los sistemas. Estas células poseen características de inmunomodulación muy adecuadas para mitigar la respuesta a cuerpo extraño que suele observarse con este tipo de implantes. En una segunda parte, se desarrolló un completo, pero al mismo tiempo sencillo, modelo matemático para el cálculo de la dosis administrada mediante sistemas de micropartículas esféricas, donde el principio activo se encuentra encapsulado en el interior de esferas de hidrogel, o cuando la molécula terapéutica es sintetizada por células inmovilizadas dentro de dichas esferas. El modelo nos da una relación entre un volumen, una cantidad de esferas y una cantidad de células o de principio activo, permitiendo una dosificación exacta y fiable, medida en unidades volumétricas. La validación de las expresiones matemáticas se llevó a cabo con el ejemplo de la tecnología de microencapsulación celular para la liberación sostenida de principios activos.

La descontaminación digestiva selectiva (DDS) es una estrategia profiláctica basada en la administración de antibióticos tópicos no absorbibles en la mucosa oral y en el tracto gastrointestinal y de un antibiótico de amplio espectro, habitualmente una cefalosporina, por vía parenteral. El objetivo es prevenir o minimizar las infecciones endógenas y exógenas producidas por microorganismos potencialmente patógenos, como Enterobacterales, Staphylococcus aureus, Pseudomonas y levaduras presentes en la orofaringe o intestino, sin dañar la microbiota anaerobia, y así reducir la mortalidad de los pacientes críticos. A pesar de los beneficios de la DDS, su utilización no se ha generalizado en los Servicios de Medicina Intensiva, debido principalmente a la percepción por parte de algunos clínicos de que promueve la selección de bacterias resistentes a los antimicrobianos. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral ha sido evaluar en el Hospital Universitario Araba (HUA), un hospital terciario de 800 camas y que tiene dos Unidades de Cuidados Intensivos (UCI), una con protocolo de DDS y otra sin protocolo DDS, si el uso de esta técnica se asocia o no con la selección de cepas resistentes. En primer lugar, se analizaron las tasas de sensibilidad de los aislados de la UCI con DDS antes y después de su implantación en 2002. Se analizaron un total de 48 combinaciones antibiótico/microorganismo durante el periodo 1998-2013. Se desarrolló un modelo dinámico lineal de series interrumpidas, introduciendo la DDS como intervención. El modelo incluyó además el número de aislados y el consumo de antibióticos. De todas las combinaciones estudiadas, tras la implantación de la DDS únicamente se detectó disminución de la sensibilidad de Escherichia coli y Proteus mirabilis a amoxicilina/clavulánico, y de Enterococcus faecalis a concentraciones elevadas de gentamicina. La disminución de la sensibilidad de E. coli y P. mirabilis a amoxicilina/clavulánico puede ser explicada por el aumento del consumo global de este antibiótico a nivel comunitario y hospitalario, y la disminución de la sensibilidad de E. faecalis a concentraciones elevadas de gentamicina puede ser debido a que la DDS favorece la selección y transmisión de enterococos. Las tasas de sensibilidad de los aislados de la UCI fueron similares o incluso mayores a las recogidas en el registro nacional ENVIN-HELICS (datos de 192 UCI, de las cuales menos del 5% aplican la DDS, por los que se consideró como referencia de UCI sin DDS). Únicamente la sensibilidad de Enterococcus faecium frente a concentraciones elevadas de estreptomicina fue menor en la UCI de nuestro hospital. En el periodo post-DDS no se detectaron tendencias en la tasa de adquisición de resistencias. Además, se analizaron las tendencias de las tasas de resistencia y consumo de antibióticos de las dos UCI del HUA durante el periodo 2014-2018. El mayor consumo de piperacilina/tazobactam y levofloxacino en la UCI sin DDS y de cefalosporinas en la UCI con DDS estuvo condicionado por el tipo de paciente ingresado en cada UCI, pacientes con cirugía gastrointestinal en la UCI sin DDS y pacientes traumáticos y neuroquirúrgicos en la UCI con DDS. Por otro lado, en la UCI con DDS se detectó una reducción significativa de la resistencia de E. coli a amoxicilina/clavulánico, que se podría relacionar con una disminución significativa del consumo de piperacilina/tazobactam. En la UCI sin DDS se detectó un aumento de la resistencia de P. aeruginosa a meropenem, que no se detectó en la UCI con DDS; esta diferencia entre las dos UCI no se puede asociar al consumo de este antibiótico, ya que fue similar en ambas. También en la UCI sin DDS se produjo un aumento significativo de la resistencia de Staphylococcus coagulasa negativo (CoNS) a linezolid y un aumento significativo de la resistencia de E. coli a levofloxacino, y de Klebsiella pneumoniae a cefotaxima y a ceftazidima, que podría ser explicado en parte, al elevado consumo de fluoroquinolonas en esta UCI. En ambas UCI hubo un aumento de la resistencia de E. faecalis y E. faecium a daptomicina. También se confirmó la elevada tasa de resistencia de P. aeruginosa a meropenem, superior a la media de las UCI españolas, que se puede relacionar con la prevalencia elevada de secuenciotipos de alto riesgo en nuestra zona geográfica. En conclusión, la implantación de la DDS no se asoció a un incremento en las tasas de resistencia, pero sí disminuyó el consumo total de antimicrobianos. El tipo de paciente atendido en cada UCI, más que la DDS, condiciona el perfil de resistencia a los diferentes antimicrobianos.

En los últimos años el aumento de las resistencias antimicrobianas ha obstaculizado la capacidad de varios antibióticos para combatir las infecciones, lo que ha disminuido la eficacia numerosos tratamientos antibacterianos. Una de las principales acciones para evitar la exacerbación de este problema es la optimización de la dosificación. Esto puede resultar especialmente complicado a la hora de tratar sujetos en los que la farmacocinética (PK) y/o la farmacodinamia (PD) de los fármacos está alterada (p.ej. en los pacientes críticos). El principal objetivo de esta tesis fue desarrollar modelos farmacocinéticos poblacionales para dos antibióticos ampliamente utilizados en el tratamiento de pacientes críticos: daptomicina y linezolid; con el fin de evaluar la adecuación de los regímenes de dosificación mediante análisis PK/PD y simulación Monte Carlo. La PK de daptomicina se ajustó mejor a un modelo mono-compartimental y la de linezolid a un bicompartimental. La eliminación de ambos antibióticos estuvo condicionada por el aclaramiento de creatinina (Clcr) y, cuando los pacientes estaban sometidos a técnicas continuas de reemplazo renal (TCRR), también por el aclaramiento extracorpóreo (CLEC). El análisis PK/PD confirmó que las dosis estándares de daptomicina no serían suficientes para alcanzar altas probabilidades de éxito de la terapia al tratar infecciones causadas por microorganismos con concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) ¿ 1 mg/L en pacientes con Clcr> 60 ml/min, o en sujetos con valores de Clcr más bajos sometidos a TCRR. En estos pacientes, se necesitarían dosis más altas. Para tratar infecciones causadas por microrganismos con CMI ¿ 4 mg/L, incluso una dosis de 840mg/24h sería insuficiente La dosis estándar de linezolid (600mg/12h) no fue capaz de cubrir las infecciones causadas por patógenos con MIC ¿ 2 mg/L. La probabilidad de alcanzar el objetivo PK/PD no mejoró sustancialmente al aumentar la dosis a 600 mg/8h, pero incrementó la probabilidad de alcanzar concentraciones de fármaco relacionadas con toxicidad. La infusión continua puede mejorar los resultados de los pacientes, especialmente en aquellos con función renal conservada.

Pseudomonas aeruginosa es uno de los principales patógenos oportunistas en humanos, este bacilo gramnegativo se caracteriza por una notable resistencia intrínseca a los agentes antimicrobianos, que ha ido aumentando en los últimos años. Ello ha provocado la aparición de cepas multirresistentes, extremadamente resistentes e incluso panresistentes. La selección del tratamiento antimicrobiano empírico adecuado implica, idealmente, el conocimiento de la prevalencia de los microrganismos en un área geográfica determinada, así como la sensibilidad a los agentes antimicrobianos. Por otro lado, la idoneidad de un tratamiento antimicrobiano está condicionada tanto por la adecuada elección del fármaco como por el régimen posológico utilizado, siendo el análisis farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD) una herramienta útil para la selección del régimen posológico con mayor probabilidad de obtener una respuesta clínica favorable. Por todo ello, el objetivo general de la tesis doctoral fue evaluar los cambios en la sensibilidad de P. aeruginosa a los agentes antimicrobianos empleados habitualmente en el tratamiento de infecciones debidas a este microorganismo, así como la aplicación del análisis PK/PD y la simulación de Montecarlo como herramienta de vigilancia microbiológica. Se evaluaron concretamente los antimicrobianos amikacina, cefepima, ceftazidima, ciprofloxacino, gentamicina, imipenem, levofloxacino, meropenem, piperacilina/tazobactam y tobramicina de cepas de P. aeruginosa aisladas en pacientes durante su ingreso en el Hospital Universitario de Álava (HUA) entre los años 2000 y 2017, diferenciándose entre aislados de la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) y de los servicios médico-quirúrgicos. En la UCI, los antimicrobianos más activos en el año 2017 fueron amikacina, cefepima, ceftazidima y piperacilina/tazobactam, observándose una reducción significativa de la sensibilidad a gentamicina y a imipenem entre los años 2000 y 2017. Los antimicrobianos que proporcionaron una mayor probabilidad de éxito en tratamiento empírico fueron meropenem 2g c/8h, ceftazidima 2g c/8h y cefepima 2g c/8h. En aislados de pacientes de los servicios médico-quirúrgicos amikacina, ceftazidima, piperacilina/tazobactam y cefepima fueron las mejores opciones terapéuticas. Teniendo en cuenta el análisis PK/PD, los antimicrobianos con mayor probabilidad de éxito en tratamiento empírico fueron meropenem, ceftazidima, y piperacilina/tazobactam, todos ellos a dosis elevadas También se evaluó la actividad antimicrobiana de aztreonam, ceftazidima/avibactam, ceftolozano/tazobactam y colistina, además de los fármacos anteriormente citados, en aislados de P. aeruginosa recogidos en el estudio llevado a cabo en 2017 por el Grupo de estudio de Pseudomonas de GEMARA-SEIMC. En tratamiento empírico, ceftazidima/avibactam, colistina, ceftolozano/tazobactam y amikacina proporcionan una probabilidad de éxito superior al 90% en pacientes no críticos, en el caso de pacientes críticos, este valor de probabilidad solo se alcanza con ceftazidima/avibactam. Asimismo, ninguno de los antimicrobianos evaluados proporciona concentraciones plasmáticas asociadas a la supresión de resistencias a las dosis empleadas en la práctica clínica. En el caso de aislados procedentes de pacientes de los servicios médico-quirúrgicos, únicamente con ceftolozano/tazobactam y ceftazidima/avibactam se alcanzan concentraciones plasmáticas que podrían asociarse a la supresión de resistencias.

La suplementación génica consiste en la administración de ácidos nucleicos (ADN o ARNm) para inducir la producción de una proteína terapéutica. En la actualidad, el uso del ARNm se ha extendido debido su alta eficacia, perfil de seguridad y versatilidad para una rápida producción de proteínas. Las partículas sólidas lipídicas (SLNs) son consideradas uno de los sistemas no virales lipídicos más eficaces para la administración de ácidos nucleicos. La terapia génica se ha propuesto como una alternativa eficaz para el tratamiento de enfermedades oculares y, en concreto, para la inflamación corneal. Los corticoides son el principal tratamiento para la inflamación corneal, pero su eficacia es limitada y presentan múltiples efectos adversos. La administración de la interleuquina 10 (IL-10) antiinflamatoria a nivel ocular se ha propuesto como una alternativa eficaz. Sin embargo, su escasa biodisponibilidad ocular y su corta vida media limitan su uso. El objetivo de la presente tesis doctoral fue el desarrollo y evaluación de sistemas de liberación de ácidos nucleicos (ADNp o ARNm) basados en SLNs para el tratamiento de la inflamación corneal mediante la administración tópica ocular. Para ello, tras la caracterización fisicoquímica y evaluación in vitro de las formulaciones en diferentes líneas celulares, se evaluó su capacidad para transfectar e inducir la expresión de IL-10 in vivo en la córnea de los ratones tras su administración en forma de colirio. Las formulaciones fueron capaces de producir IL-10 en la córnea. Este trabajo muestra el potencial de la suplementación génica no viral para el tratamiento de la inflamación corneal.

Gene therapy is based on the delivery of exogenous genetic material into target cells to modulate the expression of an altered genome in order to treat a specific disease. Lipid nanocarriers, such as niosomes based on cationic lipids, non-ionic surfactants and ¿helper¿ components, are considered attractive candidate for non-viral vectors due to their suitable biocompatibility and high versatility. The niosome chemical composition and their elaboration method influence the biophysical properties which have an impact on transfection efficiency and cytotoxicity. Indeed, compounds with specific properties have been included to overcome some disadvantages of niosome formulations, such as chloroquine, which promotes endosomal escape. Gene therapy can be an excellent treatment for many disorders, in particular cystic fibrosis that is an autosomal monogenic recessive disease caused by different mutations in the cystic fibrosis conductance regulator (CFTR) gene. In this doctoral thesis, we focused on the development and in-depth biophysical and biological characterization of non-viral vectors based on cationic niosomes to face cystic fibrosis by gene therapy approach. The data obtained support that the inclusion of the chloroquine molecule in niosome formulations improves the biophysical properties of niosomes with enhanced transfection efficiencies and lower cytotoxicity. In addition, these niosomes are able to increase the production of functional CFTR protein in cystic fibrosis cells. Furthermore, the development of a three-dimensional scaffold that better mimics the in vivo environment showed utility for evaluating new treatments and different schedules of administration for cystic fibrosis.

El término iPPSD (inactivating PTH/PTHrP signalling disorder) hace referencia a un grupo de enfermedades (epi)genéticas raras caracterizadas todas ellas por una disfunción en la cascada de señalización de PTH/PTHrP. En la presente tesis se ha trabajado con una cohorte de pacientes para identificar alteraciones en los genes asociados a iPPSD, pero también para identificar nuevos mecanismos causales mediante la tecnología de secuenciación masiva (NGS). Recientemente, se han propuesto unos criterios para proceder al diagnóstico clínico de iPPSD. En nuestra investigación también hemos intentado validar esa clasificación mediante estudios de correlación genotipo-fenotipo. Una vez identificadas las alteraciones (epi)genéticas, si las variantes no han sido descritas previamente, es necesario realizar estudios funcionales para validar la patogenicidad de dicha variante. Por tanto, es interesante poder acceder fácilmente a un buen tipo celular para utilizarlo como modelo de la enfermedad (pudiendo hacer modificaciones en su genoma). Con ese fin, se han conseguido aislar células madre mesenquimales derivadas de orina (hUSC), cuya obtención es sencilla, económica y no invasiva. Su caracterización nos ha permitido determinar que son un tipo celular adecuado para su aislamiento, mantenimiento y transporte. Finalmente, se ha analizado en las hUSC la eficiencia de transfección de los vectores no virales conocidos como niosomas catiónicos. Estos vectores son prometedores para el transporte de material genético al interior celular, ya que su fabricación es simple y económica, no presentan problemas de inmunogenicidad y tienen muy buenas características físico-químicas. Se han dado unos primeros pasos a la hora de desarrollar una estrategia de transfección en hUSCs mediante niosomas catiónicos, que podrá ser utilizada con diferentes fines, como por ejemplo terapia génica en enfermedades monogénicas.

The integration of novel compounds into formulations may open up new avenues and opportunities for improving the treatment of various diseases using a gene therapy technique. To this purpose, my thesis aimed to study the impact of incorporation of biomaterials such sphingolipids or nanodiamonds as a helper component into a cationic niosome formulation for gene delivery, the formulations and related complexes were studied in terms of particle size, surface charge, dispersity, and morphology. Furthermore, biological research were conducted in both in vitro and in vivo experimental trials to evaluate cellular uptake, intracellular trafficking pathways, and transfection efficiency.

El tabaquismo constituye la primera causa de morbi-mortalidad evitable a nivel mundial. Es uno de los mayores problemas de salud pu¿blica al que se ha tenido que enfrentar la humanidad, matando hasta la mitad de sus consumidores. Son de sobra conocidas las consecuencias nefastas para la salud producidas por el tabaco que a su vez tienen grandes implicaciones económicas. Actualmente hay diferentes maneras de abordar el tratamiento del tabaquismo, con diferentes tasas de éxito en función del tratamiento elegido, sin embargo, las recaídas son frecuentes y es necesario seguir explorando diferentes opciones que se puedan adaptar a las necesidades y expectativas de los pacientes. El auge de las nuevas tecnologías ha sido aprovechado para desarrollar estrategias basadas en telefonía móvil como herramientas de apoyo al profesional sanitario y al paciente para mejorar los resultados en salud. En este sentido se llevó a cabo un ensayo clínico aleatorio en fumadores motivados para iniciar un programa de deshabituación tabáquica en el que se evaluaba la efectividad de la mensajería móvil como herramienta adyuvante al consejo motivacional para dejar de fumar. Los pacientes asignados al grupo intervención (sms + consejo motivacional) alcanzaron mayores tasas de éxito que los del grupo control (sólo consejo motivacional) (24% frente a 12% a los 6 meses). Posteriormente, se realizó un estudio coste-efectividad comparando este programa combinado (sms+ consejo motivacional) frente a consejo motivacional únicamente, para evaluar si el coste que es necesario asumir para implantar este nuevo programa en la práctica clínica está justificado por una mayor ganancia en salud. Además, se ha realizado un meta-análisis sobre la efectividad de las aplicaciones móviles para dejar de fumar.

This doctoral thesis focuses on the design, fabrication and subsequent characterization of 3D systems that can be used to restore bone lesions. For this purpose, the principles of bone tissue engineering are applied to combine various biomaterials -both natural and synthetic- to develop gels that are suitable for bone regeneration. In order to resemble the native tissue more closely and to improve these systems' characteristics, nanotechnology has been employed by means of the utilization of nanomaterials such as nanoclays or graphene oxide. All formulations or systems created have been extensively evaluated both in vitro and in vivo. Moreover, the first designs based on alginate, hyaluronic acid and MMT have been tested for their use as delivery-platforms. In contrast, self-healing systems based on alginate, polyacrylamide and graphene oxide have been tested for their potential as scaffolds to regenerate bony lesions. All in all, this thesis encompasses the creation and further characterization of novel systems that are suitable for applications in bone tissue engineering.

Melanoma intzidentziaren igoerak, ebakuntzaz gain, tratamendu alternatiboak bilatzea eskatzen du, eta melanomaren garapenean sistema immuneak daukan zeresana azpimarratzen dute gaur egungo ikerkuntzek. Era horretara, immunoterapiaren garapenak paziente askoren eboluzioa hobetu du. Hala ere, oraindik ere ehuneko handi batek ez dio tratamenduari erantzuten, eta horrek estrategia terapeutiko berri eta anitzen beharra nabarmentzen du. Horrela, tesi honen xedea peptidoetan oinarritutako pertsonalizatutako txerto nanopartikulatuak garatzea izan da, zeintzuen helburua tumore zelulen aurkako T zelulak aktibatzea den. Melanoma pazienteen neoantigenoak erabilita, PEIz estalitako PLGAzko nanopartikulak garatu ditugu, eta, ondoren, pazientearen zelula immuneen erantzuna aztertu. Jarraian, txertoa poly(I:C) adyubantearekin prestatu genuen erantzuna handitu nahian, eta berriz ere giza zeluletan testatu. Azkenik, neoantigenoak lortzeko aukera alternatibo bat aztertzen dugu, besikula estrazelularrek azken urteotan erakutsi duten garrantzia ikusita.

La bioimpresión 3D es una emergente tecnología de fabricación aditiva que ha demostrado tener una ventaja respecto a las técnicas convencionales debido a su automatización, rapidez y reproducibilidad. En este sentido, podría ser una herramienta eficaz para la fabricación de tejidos como el cartílago y el hueso, tejidos con una gran demanda debido a la alta incidencia de lesiones osteocondrales en la población adulta y anciana. Una de las claves para obtener una buena bioimpresión 3D es la biotinta. Para ello, en esta tesis, se han desarrollado diferentes biotintas a base de polímeros naturales como la nanocelulosa (NC) y el alginato (Alg) debido a sus buenas propiedades tanto mecánicas como biológicas. Está biotinta ha demostrado tener las propiedades reológicas adecuadas para fabricar estructuras 3D estables y con una similitud al diseño asistido por ordenador. Posteriormente, a esta biotinta base se le añadió ácido hialurónico (HA), un polímero que se encuentra de forma natural en la matriz extracelular de diversos tejidos humanos. El añadir HA ha demostrado mejorar las propiedades mecánicas de la biotinta base NC-Alg. Además, se ha establecido el autoclave de ciclo corto como método de esterilización para ambas biotintas debido a que ha demostrado ser la técnica menos destructiva al compararla con la esterilización por autoclave de ciclo largo y las radiaciones ionizantes. Por último, la biotinta NC-Alg-HA ha aumentado la proliferación, viabilidad y actividad metabólica de las células mesenquimales D1 respecto a la biotinta NC-Alg, haciéndola una biotinta eficaz para su uso en la regeneración de diversos tejidos. Con el objetivo de enfocar la biotinta base NC-Alg a la regeneración de cartílago, se le ha añadido dos componentes que se encuentran en la matriz cartilaginosa como el sulfato de condroitina (CS) y el sulfato de dermatán (DS). Ambas biotintas (NC-Alg-CS) y (NC-Alg-DS) mejoraron tanto las propiedades reológicas como las biológicas en comparación con la tinta base NC-Alg. Además, las células D1 han demostrado tener la capacidad de diferenciación a cartílago aumentada con CS y DS, lo que haría a estas estructuras bioimpresas un posible tratamiento para la regeneración condral. Por último, para regenerar hueso, a la biotinta NC-Alg se ha añadido hidroxiapatita (HAP), el componente principal del hueso, y óxido de grafeno (GO), componente que ha presentado excelentes propiedades mecánicas. Ambas biotintas aumentaron las propiedades mecánicas de la biotinta base, algo necesario en la regeneración de tejidos duros como el hueso. Por otro lado, las propiedades biológicas también han visto promovidas por la presencia de HAP y GO en la biotinta. Por último, la capacidad de diferenciación ósea se ha visto aumentada en las células con ambas biotintas, siendo la biotinta NC-Alg-GO donde más indicios de diferenciación ósea se ha visto. Por ello, se podría concluir que las biotintas a base de NC-Alg desarrolladas en esta tesis podrían ser un enfoque terapéutico eficaz en la regeneración de tejidos como el cartílago y el hueso.

In this doctoral thesis, we aimed to develop a complete biomaterial, following a circular economy thinking, which can tackle multiple stages of the wound healing process. In this sense, we designed a sponge-like scaffold composed of soy protein and ß-chitin with hemostatic properties, which can be combined with mesenchymal stromal cells (MSCs), for treating different wounds. Thanks to their anti-inflammatory, immunomodulatory and proregenerative properties, the MSCs have demonstrated to be very effective for treating multiple pathologies. However, despite the use of MSCs combined with biomaterials holds a promising potential, in this work we aimed to explore also the extracelular vesicle fraction of the MSCs secretome. Thus, this cell-free alternative presents the advantages of being; more easily handled, characterized, standardized, stored and potentially safer than MSCs, while exhibiting also therapeutic properties.

La enfermedad de Fabry (EF), es una enfermedad monogénica causada por mutaciones en el gen que codifica la enzima lisosomal ¿-Galactosidasa A (¿-Gal A), y que cursa con acumulación de glicoesfingolípidos en los lisosomas celulares. Es una buena candidata para ser tratada mediante terapia de suplementación génica, ya que se debe a la alteración de un único gen. Las nanopartículas lipídicas son actualmente los sistemas no virales más eficaces para la administración de ácidos nucleicos, y su funcionalización permite dirigirlas a los órganos de interés. En la EF, se pueden dirigir a los tejidos más afectados por la enfermedad (corazón, riñones, cerebro, células del músculo liso o células endoteliales), o a órganos que pueden actuar como fábrica de la ¿-Gal A, como, por ejemplo, el hígado, para que esta sea liberada a sangre y captada por los tejidos afectados. El objetivo de esta tesis doctoral fue el desarrollo de vectores lipídicos dirigidos a hígado o células endoteliales, como sistemas de administración de un ADN plasmídico que codifica la ¿-Gal A, para el tratamiento de la EF mediante suplementación génica. Para la vectorización a hígado, se evaluaron diferentes ligandos del receptor de asialoglicoproteina, presente en la superficie de los hepatocitos: galactomanano (GM) y asialofetuina (AF). Tras la caracterización fisicoquímica de los vectores lipídicos y su evaluación in vitro, las formulaciones se administraron por vía intravenosa a ratones "knockout" para la ¿-Gal A, modelo de la EF. La funcionalización con GM incrementó la actividad ¿-Gal A a niveles clínicamente relevantes en plasma, hígado, corazón y riñones. En el caso de la funcionalización con AF, a pesar de que se incrementó la eficacia in vitro, los vectores no fueron capaces de incrementar la actividad ¿-Gal A in vivo. Por otro lado, la vehiculización a células endoteliales se llevó a cabo funcionalizando las nanopartículas lipídicas con un anticuerpo que reconoce la molécula de adhesión E-selectina. En un modelo celular de la EF (células IMFE-1) esta formulación demostró una mayor asociación celular y un aumento en la eficacia de transfección respecto a vectores no funcionalizados. Los resultados de esta tesis doctoral muestran el potencial de los vectores no virales lipídicos para tratar la EF mediante suplementación génica.

Existen actualmente una serie de enfermedades y trastornos oculares en los que, durante las últimas décadas, la búsqueda de un mejor abordaje clínico ha supuesto un continuo reto para la comunidad científica. En todas estas enfermedades, la dificultad para alcanzar una regeneración rápida y sin mermas funcionales, supone de alguna manera un denominador común. En estos casos, las denominadas terapias regenerativas autólogas de origen biológico son, y muy probablemente seguirán siendo, tratamientos de creciente relevancia dada su capacidad de reproducir eventos fisiológicos relacionados con la regeneración, presentando un elevado perfil de seguridad. Un mayor grado de conocimiento de las terapias basadas en el uso de la sangre ha promovido un creciente interés en el uso de las mismas como tratamiento en diversas patologías oculares. El plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) tiene presencia en el campo de la oftalmología desde hace unos años, donde la formulación en forma de colirio (ePRGF) se ha establecido como una alternativa terapéutica para tratar de manera tópica condiciones como defectos epiteliales persistentes o enfermedad de ojo seco entre otras. El uso de la formulación mPRGF por su parte, ya ha sido reportada previamente en diversas áreas de la medicina dada su capacidad de servir como un tejido temporal de soporte, así como de retener y liberar de manera sostenida factores de crecimiento necesarios para la regeneración tisular. Los resultados obtenidos en los trabajos de pterigion tanto primario como recidivado defienden su eficacia y seguridad como un injerto temporal que promueve la regeneración tisular presentando bajas tasas de recidiva tanto en casos de pterigion primario como recurrente, así como buenos datos en las variables de inflamación, agudez visual, calidad de la superficie ocular o dolor. Estos resultados respaldan su uso en casos recidivados o cuando existe limitada cantidad o calidad del tejido conjuntival. La formulación denominada immunosafe ePRGF (is-ePRGF) que inactiva el sistema de complemento mediante un tratamiento de calor, ha permitido abordar con mayor solvencia los tratamientos oculares para pacientes con patologías autoinmunes. En el caso de las conjuntivitis cicatrizantes, los resultados obtenidos demuestran tanto seguridad, como una mejoría en la gravedad de la patología y la inflamación, debido a sus capacidades moduladoras de la respuesta inmune y la fibrosis.

La resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos es uno de los mayores problemas de salud pública a nivel mundial, ya que podría convertirse en la principal causa de muerte de aquí a 2050. Entre las diversas estrategias para combatir dicha resistencia, el desarrollo de nuevos antibióticos y la optimización del uso de los ya existentes son dos de las más importantes. Por tanto, el objetivo de esta tesis doctoral ha sido la aplicación de diferentes enfoques de modelado y simulación farmacocinética para la evaluación y optimización de la terapia antimicrobiana. Se realizó una revisión sistemática que resaltó el reciente impulso en el desarrollo de nuevas combinaciones de beta-lactámicos con inhibidores de beta-lactamasas, así como la limitada disponibilidad de metalo-beta-lactamasas de clase B para uso clínico. Se desarrolló y validó un método HPLC-UV rápido y sensible para cuantificar ceftarolina en muestras de plasma, útil para estudios farmacocinéticos y monitorización terapéutica en pacientes críticos. En diversas modalidades de reemplazo renal continuo, tanto ceftarolina como avibactam fueron eliminados en gran medida, lo que sugiere la necesidad de ajustar las dosis en pacientes sometidos a estas terapias. La farmacocinética de fosfomicina cálcica tras su administración oral en mujeres sanas se describió con un modelo bicompartimental. Se observó que una dosis de 1000 mg cada 8 horas durante tres días podría ser efectiva para tratar infecciones urinarias; sin embargo, se requieren más estudios para confirmarlo. Los datos de piperacilina se describieron mejor con un modelo bicompartimental. Los resultados confirmaron que la administración de piperacilina en infusión prolongada de 4 h o infusión continua proporcionan una mayor probabilidad de éxito del tratamiento que la infusión corta de 0.5 h. Se desarrolló un modelo fisiológico para meropenem tras su administración intravenosa en pacientes críticos, que demostró que los parámetros más sensibles que afectan a la farmacocinética de meropenem son la tasa de filtración glomerular y la unión a proteínas plasmáticas, y en menor medida el hematocrito. En resumen, los resultados de esta tesis confirman la utilidad de los diferentes enfoques de modelado farmacocinético y análisis PK/PD para evaluar y guiar los regímenes de dosificación de antibióticos, lo que contribuye a mejorar la precisión, la eficacia y la seguridad de la terapia antimicrobiana.

This doctoral thesis focuses on the development and evaluation of bioinspired hydrogel-based systems for tissue regeneration and drug delivery. For this purpose, different approaches of hydrogel-based systems are examined. Tissue engineering combines natural biomaterials to engineer systems suitable for bone regeneration. With the aim of simulating native tissue and improve the characteristics of these systems, nanotechnology has been employed by using nanomaterials such as nanoclays. The first design is a 3D system based on nanoreinforced gelatin that has been tested as a scaffolding system that can act as delivery platform. For this purpose in vitro and in vivo studies were carried out. The second approach, in turn, tested the potential of bioadaptable systems based on a combination of DNA and BSA as scaffolds to regenerate bone fractures. Evaluation was carried out by a set of assays in terms of biomechanical, morphological and chemical characterization. Overall, this thesis comprises the design and fabrication and subsequent characterization of innovative systems that are suitable for bone tissue engineering.

Tendon injuries are a significant global health problem. Traditional treatments are often inadequate for effective rehabilitation. Therefore, there has been a shift towards the use of tissue engineering for tendon regeneration. The aim of this thesis was to develop advanced therapy products by combining hydrogels, 3D bioprinting, electrospinning, cell therapy and growth factor therapy to enhance tendon regeneration. Five specific objectives were outlined: (i) to develop a biomimetic hydrogel for tendon regeneration, (ii) to fabricate 3D bioprinted scaffolds with embedded cells and growth factors for the treatment of partial tendon injuries and (iii) to evaluate cell behavior, the release profiles of growth factors, and the activity of these released growth factors in vitro, (iv) to fabricate hierarchical composite scaffolds for the treatment of total tendon injuries and (v) to evaluate their mechanical properties and assess their ability to retain cells, as well as to investigate cell behavior including proliferation, gene expression activity, and other cellular responses within the scaffold. The methodology involved a literature review for the design of a biomimetic hydrogel mimicking tendon properties. This hydrogel was characterized for various applications such as 3D bioprinting and injection. Tenocyte loaded scaffolds and growth factor loaded scaffolds were 3D bioprinted using the developed hydrogel as bioink. Cell performance, release kinetics and efficacy of the released growth factors were evaluated for tendon partial rupture regeneration. Complex hierarchical scaffolds were fabricated using electrospinning and hydrogel injection. The mechanical properties and cell behavior of the embedded tenocytes were thoroughly evaluated. The results showed promising outcomes: the developed biomimetic hydrogel successfully mimicked native tendon matrix properties, the 3D printed scaffolds exhibited suitable properties for treating partial tendon injuries, biocompatibility evaluations showed good viability and activity of the embedded tenocytes and the released growth factors facilitated vascularization and cell proliferation. Composite hierarchical scaffolds exhibited enhanced biomimetic properties and improved cell behavior, providing a structure that closely resembles native tendons and providing favorable conditions for cell growth and tissue regeneration. The integration of hydrogel and electrospun fibers resulted in scaffolds with superior mechanical properties and improved elasticity, which are critical for effective tendon repair. In conclusion, this work represents a significant advancement in tendon tissue engineering, providing insights and methods to effectively treat tendon injuries and potentially improve clinical outcomes.

El impacto ambiental de los medicamentos es un problema de gran magnitud, que afecta tanto a la salud humana como a los ecosistemas. Debido a que el consumo de medicamentos, tanto de uso humano como de uso veterinario, está aumentando a nivel mundial, se espera que el volumen de residuos medicamentosos también se incremente. La farmacontaminación es un problema complejo que debe ser abordado de forma interdisciplinar, incluyendo a todos los agentes que participan en el ciclo de vida del medicamento. Son muchos los desafíos pendientes en el manejo de la farmacontaminación, y por ello es necesario abordar algunos de estos retos de forma experimental, teniendo en cuenta el punto de vista de los profesionales de la salud. En esta tesis, en primer lugar, se ha estudiado la presencia ambiental (en aguas residuales) de los fármacos utilizados en Vitoria-Gasteiz durante la primera ola de la pandemia del SARS-CoV-2 (abril-julio 2020) para el tratamiento de la COVID-19, evaluándose también su potencial riesgo ecotoxicológico. Se midió, por primera vez, a nivel mundial, hidroxicloroquina en el medio ambiente. y por segunda vez, lopinavir. Teniendo en cuenta las concentraciones ambientales medidas en el estudio, se estimó un riesgo ecotoxicológico moderado para azitromicina y bajo para hidroxicloroquina y lopinavir-ritonavir. Por otro lado, se ha revisado la presencia en el medio ambiente de los fármacos peligrosos en entornos sanitarios (según la lista NIOSH, grupo 1: carcinogénicos) y se ha evaluado su potencial riesgo ecotoxicológico, basándose en los datos disponibles en la literatura. En base a los resultados, se puede afirmar que la mayoría de los fármacos peligroso del grupo 1 de la lista NIOSH no se ha intentado medir en el medio ambiente y que no se pudo establecer una evaluación del riesgo ecotoxicológico para la mayoría de ellos. Por lo que se puede concluir que el impacto ambiental de los fármacos peligrosos del grupo 1 de la lista NIOSH no está suficientemente estudiado. Por último, se ha estudiado el impacto de la farmacontaminación en los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS), ya que, si bien la evaluación del impacto ambiental de los medicamentos se considera una línea de investigación prioritaria para determinadas instituciones relacionadas con la salud y el medio ambiente, la relación de la farmacontaminación con los ODS no ha sido propiamente determinada. La farmacontaminación podría afectar al menos a 12 de los 17 ODS. Por ello, la lucha contra la farmacontaminación podría ser esencial para alcanzar los ODS.

Las vacunas tradicionales presentan varios inconvenientes, como el escaso cumplimiento terapéutico, los elevados costos y la escasa o nula protección de las mucosas y la piel. Estos problemas pueden superarse mediante el uso de tecnologías avanzadas, dispositivos médicos y vías de administración alternativas. En esta tesis, se investigaron los liposomas como vehículos para la administración del antígeno modelo ovoalbúmina debido a su doble función como sistemas portadores de antígenos y adyuvantes de vacunas. Se eligió la sonicación directa como método de preparación más ecológico. La composición se adaptó a la vía de administración seleccionada (piel, nariz y pulmones). Se implementaron estrategias como la oclusividad (mediante una película adherente e hidrogel) y la adhesividad (mediante liposomas catiónicos), así como el uso de dispositivos médicos (aerosol nasal e inhaladores de polvo seco) con el fin de 1) evitar la inyección, 2) facilitar la aplicación y 3) mejorar la protección local.

La farmacontaminación es un problema global que tiene un gran impacto ecotoxicológico. El primer paso para combatirlo es conocer el grado de contaminación y las vías por las que los medicamentos alcanzan el medioambiente, empezando por uno de los puntos calientes de mayor relevancia: los efluentes hospitalarios. En ellos se ha hallado en ellos gran variedad de fármacos, aunque existe una enorme laguna de conocimiento sobre varias clases terapéuticas. Una vez en el medioambiente, algunos fármacos pueden bioacumularse en los seres vivos, por lo que la presente tesis ha analizado su presencia en delfines, hecho documentado por primera vez a nivel mundial. Se detectó al menos un fármaco en el 70% de los delfines analizados. Por último, en cuanto a las soluciones, la implicación de los profesionales sanitarios y sus conocimientos sobre los fármacos podría suponer un gran avance en esta línea.