Doctoral theses defended

El conocimiento asociado al metabolismo de fármacos aún sigue siendo desconocido a pesar de los avances realizados en la farmacología aplicada a la población pediátrica. Este hecho se debe principalmente a problemas éticos que dificultan el desarrollo de ensayos clínicos en esta población. Como consecuencia, la administración de fármacos en niños se hace en base a cálculos empíricos de la dosis administrada en adultos. Esta práctica puede conllevar a una dosis ineficaz o incluso tóxica, ya que no se tiene en cuenta el desarrollo biológico del niño ni la maduración de los órganos, que se estima al alcanzan la madurez total a los 2 años de vida. La metabolómica, dada su capacidad de estudiar y comparar perfiles metabólicos, es una herramienta de gran utilidad para comparar los perfiles metabólicos de individuos de diferente edad y poder obtener potenciales biomarcadores. La dificultad de obtener muestras en niños ha dado lugar al empleo de modelos animales (minipigs).Por lo tanto, los objetivos que se han planteado en esta tesis doctoral son: (1) la búsqueda de metabolitos que diferencien los perfiles metabólicos de plasma e hígado en modelo animal minipig empleando la técnica analítica de cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS); (2) establecer la potencialidad del plasma como biofluido de análisis que refleje el estado del hígado; y (3) puesta a punto de un protocolo para estudios de metabolómica no dirigida.La consecución de estos objetivos ha permitido obtener una serie de resultados que indican que las acilcarnitinas y los glicerofosfolipidos (GLPs) son los metabolitos diferenciadores de edad en hígado y plasma, respectivamente. Asimismo, se ha obtenido que el plasma puede emplearse como un biofluido, de extracción poco invasiva, que refleja el estado del hígado, hallazgo que es de vital importancia para futuras aplicaciones en población pediátrica humana. Finalmente, se ha optimizado un protocolo para metabolómica no dirigida, que podrá emplearse en futuros estudios metabolómicos.

En la presente tesis doctoral se ha trabajado con la hipótesis de que existe un conjunto de procesos y presiones selectivas que afectan a los genes HLA clase I y II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de manera diferencial, tanto entre regiones de los propios genes, como entre los genes al completo y entre distintas poblaciones humanas. Además se ha considerado la idea de que, a lo largo del proceso evolutivo (donde se cree tuvo gran importancia la relación entre Homo sapiens y humanos arcaicos como Neandertales y Denisovanos) y colonizador humano (desde la salida de África hasta la actualidad), estas presiones selectivas han dejado su marca en el genoma, y que estas marcas pueden usarse para estudiar la historia evolutiva de nuestra especie.

El cromosoma Y determina el sexo masculino y posee una naturaleza haploide que escapa a la recombinación, lo que hace que sólo esté presente en individuos varones y que se trasmita prácticamente sin cambios de padres a hijos, estableciendo linajes paternos. El estudio de los linajes paternos, mediante polimorfismos de un solo nucleótido (single nucleotide polimorphism, SNP) en el cromosoma Y (Y-SNP), permite la reconstrucción de la historia evolutiva de los linajes paternos de la especie humana. Los marcadores genéticos del cromosoma Y pueden ser de dos tipos, los anteriormente mencionados Y-SNPs, y los microsatélites Y-STRs (short tandem repeat, STR). Su estudio permite conocer cuáles son los linajes paternos característicos o presentes en cada población humana, permitiendo así diferenciar entre unas poblaciones y otras. Por ello, en los últimos años su estudio es relevante dentro del área de la Genética Forense y otras áreas afines como la genética de poblaciones, genealogía genética o la genética evolutiva. El estudio de los Y-SNPs ha revelado que las agrupaciones de linajes paternos, también llamadas haplogrupos, se distribuyen en áreas geográficas concretas a lo largo del mundo, tanto continental como regionalmente. En el caso del oeste de Europa el haplogrupo más común es R1b-M269. La actual composición genética de Europa ha sido objeto de múltiples controversias centradas alrededor del origen de M269, ya que las estimaciones de edad obtenidas a partir de los distintos estudios genéticos realizados por distintos autores situaron el origen de este linaje paterno tanto durante el periodo Paleolítico, como en tiempos más recientes, en el Neolítico. El objetivo principal de este estudio se centra en la reconstrucción del escenario evolutivo más probable del principal linaje paterno europeo M269 en la Península Ibérica y el suroeste de Europa a través de la disección en sus subhaplogrupos, lo que permitirá caracterizar de manera detallada la distribución de los linajes paternos presentes en la Península Ibérica e inferir el papel de esta región en la historia evolutiva de Europa. Los resultados obtenidos han permitido caracterizar el paisaje genético paterno del suroeste de Europa, revelando, por un lado, que el origen más probable de M269 sea el Este de Europa y, por otro lado, que uno de los sublinajes principales de M269, R1b-S116, presenta un patrón de distribución distinto al propuesto anteriormente por otros autores. Además, el paragrupo de S116, S116*, fue prácticamente resuelto por la presencia del sublinaje R1b-DF27, que ha resultado ser casi específico de la Península Ibérica, haciendo de él un marcador de potencial interés forense para la determinación de la ancestralidad biogeográfica paterna. Las estimaciones de edad de DF27 indican que se originó hace 4.000-4.200 años, durante la transición entre el Neolítico y la Edad de Bronce, siendo su lugar más probable de origen la región noreste de la Península Ibérica. Por otro lado, fruto de este estudio también se han desarrollado dos paneles multiplex de Y-SNPs e Y-STRs para su uso en Genética Forense y de poblaciones. En conclusión, el presente trabajo de tesis doctoral ha proporcionado, por un lado, nuevas pistas sobre la historia evolutiva de acervo genético europeo actual y, por otro lado, dos nuevas herramientas de uso forense para el análisis multiplex de Y-SNPs e Y-STRs.

La presente tesis se ha desarrollado con el objetivo principal de avanzar en el conocimiento y las posibilidades de los polímeros de huella molecular (MIP) como materiales de reconocimiento de compuestos quirales, en concreto del fármaco antidepresivo citalopram. La quiralidad es responsable de las diferencias entre la farmacodinámica y farmacocinética de cada uno de las enantioformas, por ello es importante disponer de técnicas analíticas específicas que permitan determinar de forma rápida y efectiva la enantioforma activa del fármaco. En este sentido, en esta tesis los polímeros de huella molecular se han aplicado a dos técnicas analíticas diferentes. Por un lado, se ha desarrollado un sensor potenciométrico basado en la implementación de nanopartículas impresas molecularmente en una membrana de policloruro de vinilo. Este sensor ha permitido cuantificar la enantioforma S del citalopram en muestras de orina. Por otro lado, se ha llevado a cabo la síntesis de un material de relleno para columnas cromatográficas que han permitido la enantioseparación de ambos enantiómeros mediante cromatografía líquida de alta resolución. Para la síntesis de esta fase estacionaria quiral, se han seguido dos estrategias, la impresión en superficie y la unión de nanopartículas en superficie, siendo esta última la que ha dado lugar a un buen desarrollo cromatográfico.

La presente tesis se ha basado en la síntesis y aplicación de polímeros de huella molecular (MIP) para el análisis químico del 4-etilfenol y los compuestos pertenecientes a su ruta metabólica, que son el etil ester de ácido cumárico, el ácido cumárico y el vinilfenol. Los fenoles volátiles como el 4-etilfenol y el 4- vinilfenol afectan a las características organolépticas del vino, siendo perjudiciales en altas concentraciones. El nivel de 4-etilfenol es proporcional a la concentración y la actividad de la levadura responsable de su aparición en vino, y por lo tanto puede ser utilizado como un indicador de su presencia. El trabajo experimental se ha sido divido en dos secciones principales, en función de la técnica analítica en la que ha sido implementado el material impreso desarrollado. Inicialmente, se presenta una metodología para el desarrollo y aplicación de fases estacionarias basadas en MIP. Los materiales desarrollados han sido evaluados como fases estacionarias en extracción en fase sólida y cromatografía líquida. Como segundo apartado del trabajo, se describen distintas técnicas de impresión molecular para su implementación en sensores voltamperométricos, por un lado, la síntesis de películas MIP sobre electrodos de oro y por otro, la síntesis de nanopartículas MIP y su posterior inmovilización en la superficie de electrodos de oro.

En la presente Tesis Doctoral se ha incidido especialmente en establecer la naturaleza de los animales estabulados a lo largo del tiempo, en abrigos de ontaña de la Sierra de Cantabria y la Sierra de Atapuerca, certificados por excacaciones arqueológicas realizadas entre los años 1964 y 1997. Se han desarrollado para ello nuevos métodos analíticos para la detección de biomarcadores específicos de cada especie animal, se ha datado el origen de las muestras mediante las relaciones entre biomarcadores y finalmente se ha pretendido agrupar todos los datos obtenidos para dar respuestas a las diferentes preguntas que surgen desde la Arqueología: cuál es la naturaleza de la cabaña estabulada, en qué épocas históricas se ha producido esa estabulación y cuáles son las actividades y costumbres pastoriles.

Actualmente, la demanda por los análisis de parentesco y la identificación genética se han convertido en un tema de interés social. Del mismo modo, la identificación de personas desaparecidas en desastres de masas, tanto naturales como producidos por el hombre, es un tema candente. En España, el número de personas no identificadas que fueron asesinadas y ejecutadas durante la Guerra Civil Española (17 de Julio de 1936 ¿ 1 de Abril de 1939) y la posterior dictadura sigue siendo muy elevado. Es por ello que los análisis genéticos tienen un valor añadido en esta población. En este contexto, el tipo de relaciones estudiadas generalmente no se corresponden con familiares cercanos sino de segundo o tercer grado, tales como abuelo-nieto, medias hermanas por parte de padre, tía-sobrino, etc. Los conjuntos de marcadores genéticos localizados en los cromosomas autosómicos actualmente empleados para la identificación genética pueden resultar insuficientes a la hora de estudiar algunas relaciones de parentesco complejas. Sin embargo, los marcadores microsatélites localizados en el cromosoma X (X-STRs) pueden ayudar a resolver ciertos casos complejos de parentesco. Los dos conjuntos de marcadores X-STRs actualmente empleados en Genética Forense están compuestos por 10 y 12 marcadores microsatélites. En términos de poder de discriminación, cuanto mayor sea el número de marcadores, mayor será el poder de resolución. Teniendo esto en cuenta, el objetivo del presente trabajo ha sido desarrollar una nueva reacción de análisis simultáneo de 17 X-STRs siguiendo las recomendaciones de la SWGDAM para su aplicación a muestras de ADN altamente degradado y escaso en el ámbito forense. Además, los polimorfismos de base única localizados en el cromosoma X (X-SNPs) también han demostrado su utilidad en la resolución de casos complejos. Es por ello que se ha llevado a cabo la evaluación in silico de la eficiencia forense de los marcadores X-SNP con tres y cuatro alelos polimórficos.

El prerrequisito crítico en entomología médico-legal y veterinaria es la rápida y precisa identificación de la entomofauna recogida para estimar el periodo de actividad de los insectos (PAI), que se aproxima al intervalo post-mortem (IPM). La aplicación principal del análisis molecular es el diagnóstico inequívoco de insectos a nivel de especie, si bien, en determinadas situaciones los insectos presentan también un gran interés como reservorio de ADN de la fuente de alimento. En este contexto, el presente estudio explora la ciencia entomológica desde un punto de vista molecular, tratando aspectos clave en las investigaciones forenses. A día de hoy, la metodología de referencia para el análisis molecular combina amplificación y secuenciación de ADN. Por ello, inicialmente el trabajo se centró en evaluar la idoneidad, eficacia y precisión de los análisis con marcadores mitocondriales y nucleares en dípteros de interés médico-legal y veterinario del centro y sur de Europa. Con este fin, examinamos marcadores de ADNmt [COI barcode (658 pb), COI (616 pb), COII (725-731 pb), Cyt-b (307 pb) y Cyt-b-ARNtser-ND1 (495-496 pb)] y ADNnu [ITS2 (310-352 pb) e ITS12 (1081-1083 pb)] en las familias Calliphoridae (Chrysomya albiceps, Phormia regina, Calliphora vicina, C. vomitoria, Lucilia sericata, L. richardsi, L. ampullacea, L. silvarum, L. caesar, L. illustris y L. bufonivora), Muscidae (Musca autumnalis) y Oestridae (Hypoderma bovis). La mayoría de los Calliphoridae estudiados se utilizan habitualmente como indicadores en el centro y sur de Europa. En general, COI 616 pb y Cyt-b destacaron como herramientas diagnósticas entre los loci mitocondriales. Sin embargo, únicamente la región nuclear ITS2 permitió la diferenciación consistente incluso entre las especies de los géneros más complejos. Por su parte, el análisis del marcador COI barcode hizo posible confirmar la presencia de L. bufonivora en la Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV), así como de M. autumnalis en el sur de la misma (Álava). Globalmente, esta investigación resulta de incuestionable valor considerando la escasez de datos genéticos sobre las especies de interés médico-legal y veterinario en el sur de Europa. Asimismo, uno de los retos de la biología molecular moderna es el desarrollo e integración de nuevas tecnologías que mejoren las prestaciones de las convencionales. El análisis HRM es un método robusto que ofrece un considerable ahorro de tiempo y costes. Por este motivo, hemos desarrollado y validado un ensayo mediante el análisis HRM de la región ITS2 (HRM-ITS2), para el diagnóstico de califóridos de interés médico-legal y veterinario. Nos centramos, principalmente, en los dípteros necrófagos del sur de Europa más difíciles de identificar morfológicamente. Los resultados demostraron la robustez del análisis HRM-ITS2 en la diferenciación rápida y fiable de especies, en un único paso en tubo cerrado. De esta forma se reduce el riesgo de contaminación, aspecto esencial cuando se trabaja con evidencias forenses. En el ámbito médico-legal, la utilización de los insectos en estadios inmaduros como fuente de ADN del hospedador, se limita principalmente a situaciones simuladas y de difícil extrapolación. Por ello, nuestra meta fue recuperar y analizar, de forma efectiva, el ADN contenido en los buches de larvas procedentes de casos reales. La identificación individual humana se hizo con sistemas comerciales de amplificación de loci STRs, mientras que para el diagnóstico a nivel de especie se utilizó el locus Cyt-b. Los resultados demostraron que la calidad y cantidad de ADN extraído estaba relacionada con la apariencia y el tamaño de los buches. Los loci STRs amplificados coincidieron con los perfiles de referencia. La caracterización del marcador Cyt-b fue satisfactoria, incluso cuando el genotipado de loci STRs falló. Finalmente, tratamos de contribuir al desarrollo de la investigación forense en la CAPV con la revisión de un protocolo para la recogida, procesamiento y registro de evidencias entomológicas en formato bilingüe (Castellano y Euskera).

El objetivo principal de este proyecto de tesis ha sido tratar de desentrañar el misterio tras la peculiar distribución de los haplotipos MAPT en el mundo en general y muy en particular en el continente europeo, de donde es prácticamente exclusiva una de sus principales configuraciones (MAPT*H2), presentándose con una frecuencia media de 0,2. En un principio, la hipótesis que se barajó para explicar la distribución de las frecuencias actuales de MAPT y pareció confirmarse tras los primeros resultados, fue que la mayor presencia del haplotipo MAPT*H2 en el sur de Europa, con una frecuencia récord en la población vasca estudiada en el laboratorio, se podía deber a la huella dejada por la migración desde el refugio glacial franco-cantábrico hacia otros lugares del continente siguiendo la retirada de los hielos tras la última glaciación. La construcción de una gran base de datos para las frecuencias MAPT a partir de datos bibliográficos y de aquellos obtenidos en el laboratorio permitió realizar una serie de análisis, entre cuyos resultados se destacó una clina en la que las frecuencias del haplotipo menos habitual, MAPT*H2, disminuían de manera significativa en dirección sureste-noroeste. Posteriormente pudo ampliarse la base de datos añadiendo frecuencias de MAPT de poblaciones Paleolíticas y Neolíticas. Al analizar la información aportada por el ADN antiguo, el equipo descubrió que la variante MAPT*H2 apenas estaba presente en las muestras del Paleolítico, por lo que la primera hipótesis propuesta hubo de ser rechazada. En cambio, se observó un aumento de las frecuencias de MAPT*H2 en Oriente Próximo, hace entre 10.000 y 7.000 años, y varios picos posteriores en otras regiones de Europa. Este patrón, invisible hasta aquel momento, explicaba una historia completamente distinta: el haplotipo MAPT*H2 había permanecido en el acervo genético del ser humano a frecuencias muy bajas (inferiores a 0,1) e incluso indetectables hasta la revolución neolítica. El rápido aumento de población en Oriente Próximo debido a la adopción de la agricultura generó un efecto fundador in situ, elevando las frecuencias del haplotipo MAPT*H2 por encima del 0,15. Con la migración de los primeros agricultores y la expansión de este modo de vida, se produjo una serie de efectos fundador en Europa y el haplotipo minoritario alcanzó frecuencias más similares a las actuales (incluso más altas) en varios puntos y en varias épocas distintas. Teniendo en cuenta las diferencias entre la distribución actual de las frecuencias de los haplotipos MAPT y aquella descrita para épocas prehistóricas, la primera debe ser resultado de fenómenos más recientes, que esperamos puedan ser estudiados en próximos trabajos.

El cultivo celular es una herramienta poderosa que permite estudiar los procesos celulares de una manera sencilla. Aunque los métodos convencionales cultivo han permitido obtener inmensurable conocimiento en muchísimas áreas, incluyendo la biología celular y la biomedicina, siempre se ha requerido de estudios in vivo complementarios debido a la falta de control de las interacciones y los microambientes celulares en los métodos convencionales de cultivo. La microfabricación permite la generación de nuevos sistemas y plataformas que aporten un mayor control del cultivo celular, así como una monitorización más eficiente de sus procesos. En esta tesis, se ha combinado la microfabricación, la ciencia de materiales, la bioquímica y la biología celular para el desarrollo de una herramienta de monitorización celular. Para ello, se han desarrollado nuevos sensores para la secreción celular y patrones combinados de células y microesferas que permitan el control de las interacciones celulares, la presentación eficiente de moléculas señalizadoras a las células y la detección directa de la secreción celular incorporando los biosensores desarrollados.

N6-metiladenosina (m6A) es una de las modificaciones más abundante del ARNm presente en los organismos eucariotas. Distintos estudios han revelado que la modificación m6A está involucrada en la regulación de la mayoría de los procesos del metabolismo del ARNm. Sin embargo, aún no existe mucho conocimiento acerca del impacto que esta modificación tiene sobre la regulación de la expresión génica, su función en los procesos celulares y el efecto que puede ejercer en el desarrollo y progresión de ciertas enfermedades, como, por ejemplo, el cáncer de mama. Por tal motivo, en este estudio, exploramos la presencia de la modificación m6A en el cáncer de mama, específicamente en los subtipos moleculares luminal A, luminal B HER2-, luminal B HER2+, HER2+ y triple negativo, con el fin de determinar el estado de la metilación del ARN y de su posible relación con futuras dianas terapéuticas. Para ello, se ha evaluado el estado de la metilación m6A y de la expresión de las principales metiltransferasas y desmetilasas en muestras provenientes de los mencionados subtipos moleculares de cáncer de mama. También, se han identificado m6A-SNPs relacionados con esta enfermedad y se ha determinado el perfil de metilación m6A presente en todo el transcriptoma de los distintos subtipos moleculares mediante el uso de la técnica MeRIP-seq. Los resultados obtenidos muestran la presencia de metilación m6A en numerosos ARNms de genes altamente relacionados con el inicio y desarrollo tumorales lo que genera nuevas vías de estudio en esta enfermedad.

La valoración del perjuicio estético surgió dentro de la valoración del daño corporal en la década de los 80 del siglo XX. Existen muchos autores que formulan diversos métodos para valorarlo. Sin embargo, no existe un sistema o método que se acomode de forma objetiva a los parámetros legales de la actual Ley 35/2015. El objetivo de este estudio ha sido determinar si tras la entrada en vigor de la Ley 35/2015 en la valoración del perjuicio estético se ha dado un incremento o decremento, al valorar el perjuicio estético; bien en la cuantificación económica y/o en términos de grados de perjuicio estético respecto a la anterior legislación, el RD 08/2004. Además de determinar esta diferencia, también se ha comparado por sexo, identificado si la puntuación obtenida coincide con el grado estético, y la zona afectada, mediante nuevas variables obtenidas de la revisión bibliográfica. La investigación que se ha desarrollado es de tipo descriptivo, con una muestra de 740 personas. El periodo de estudio comprende desde 2012 a 2019, cuatro años para cada normativa, y los datos son obtenidos mediante base de datos, de los accidentes de tráfico con perjuicio estético atendidos por Seguros Lagun Aro S.A. Las variables estudiadas comprenden; el grado de perjuicio estético, el sexo, la edad, tiempo de gestión del siniestro, valoración pericial de la persona, y las variables que definen y delimitan el perjuicio estético. Los resultados muestran diferencias significativas entre ambas normativas mediante ¿Test de Wilcoxon¿ y un valor ¿p 0,000¿. También ha diferencias por sexo con ¿p 0,012¿ mediante ¿U de Mann-Whitney¿, y correlación entre la puntuación obtenida por perjuicio estético y grado estético mediante la ¿Rho de Spearman¿, en ambas normativas con valor ¿Rho 0,663¿ y ¿Rho 0,664¿, para la Ley 35/2015 y el RD 08/2004 respectivamente. Por contra no hay correlación entre el grado estético y la zona afectada o región anatómica, al contrario que sucede con el resto de las variables que definen y delimitan el perjuicio estético. Las conclusiones, además de las cuatro descritas en los resultados, muestran respecto a la Ley 35/2015, lo siguiente: las orientaciones cualitativas no se han visto cumplidas, el uso de los baremos existentes para la valoración del perjuicio estético incluye elementos no permitidos por ésta. Además, no existe ninguna descripción que nos permita la aplicación de un perjuicio excepcional, en la aplicación del daño moral complementario sería más razonable que se aplicase en el grado muy importante, no describe la aplicación de secuelas interagravatorias o secuelas que supongan un agravamiento de un estado anterior. Además, en toda la bibliografía consultada no se ha encontrado, forma de incardinar en un grado concreto de perjuicio estético, aquellas lesiones o alteraciones que suponen la afección del habla, el mal olor corporal, halitosis, mímica facial¿, si bien normalmente se propugna su inclusión como un perjuicio estético dinámico.

En el trabajo de investigación desarrollado dentro de la tesis doctoral titulada Pilgrimage to Santiago de Compostela: Osteological and Biomolecular Analisis of Medieval Individuals, se busca dilucidar cómo se desarrolló la sociedad en el centro y a lo largo de la principal ruta de peregrinación europea durante la Edad Media, el Camino de Santiago. Por medio de una combinación de análisis osteológicos, isótopos estables (87Sr/86Sr, ¿18O, ¿13C, ¿15N), y de dataciones de C14, se estudian las migraciones humanas pasadas y sus implicaciones sociales y económicas tras examinar a 359 individuos (196 humanos, 163 fauna) procedente de 28 yacimientos arqueológicos localizados a lo largo del norte de la Península Ibérica y con una cronología de entre los siglos IX-XV d.C.

El diagnóstico precoz de la enfermedad renal crónica (ERC) en pacientes pediátricos posibilitaría una intervención terapéutica eficaz para el retardo de su progresión y la aparición de complicaciones. Sin embargo, la creatinina, utilizada en la práctica clínica para el diagnóstico de ERC, se encuentra lejos de ser el biomarcador ideal para su detección precoz. La metabolómica es una herramienta que permite la búsqueda e identificación de biomarcadores mediante el estudio sistemático de perfiles metabólicos en un conjunto de muestras biológicas. Con el objetivo de encontrar nuevos biomarcadores, se ha optimizado un método de metabolómica dirigido LC-QTOF-MS para cuantificar 16 metabolitos pertenecientes a las rutas metabólicas arginina-creatina, metilación de la arginina y ciclo de la urea. Tras aplicar este método a muestras de plasma de pacientes pediátricos con ERC y controles, 4 de éstos resultaron biomarcadores potenciales. Asimismo, se ha desarrollado un método de metabolómica no dirigido que permitió identificar 4 posibles biomarcadores en estos pacientes. Finalmente, se ha optimizado un método LCQQQ- MS de rutina para el análisis de los 8 metabolitos identificados como biomarcadores potenciales en los métodos analíticos previos y se ha aplicado a muestras reales.

Las células madre del folículo piloso humano (hHF-MSCs) se encuentran en el compartimento mesenquimal del folículo, que está formado por la papila dérmica, la vaina dérmica y la región peribulbar. Estas células se caracterizan por su alto potencial regenerativo sin la generación de procesos fibróticos en la cicatrización de heridas, y han mostrado beneficios frente al empleo de MSCs de otras fuentes de procedencia cuando han sido transplantadas. Sin embargo, su uso está aún por explorar en un amplio rango de terapias celulares de reemplazamiento y secreción de factores de crecimiento para la reactivación de células madre endógenas. El folículo piloso es una rica y fácilmente accesible fuente de MSCs. El presente trabajo muestra el desarrollo de una metodología que simplifica el aislamiento y enriquecimiento de hHF-MSCs de la región occipital del cuero cabelludo de donantes de entre 20 y 40 años, y que, a su vez, favorece su capacidad de duplicación y predice la probabilidad de éxito en la obtención de cultivos proliferativos, lo que facilita su adecuación para su futuro uso en terapia celular.

Whenever a crime is committed, there is always a unity of time, place and action that forensic experts will aim to demonstrate throughout the investigation. Determining the succession, simultaneity, frequency or duration of criminal activities as well as the age of objects, persons and traces is therefore one of the most important goals of forensics in reconstructing the crime scene or in finding and understanding the connections between the evidence and the suspects involved therein. However, time has been largely unexplored due to the complexity of the overall challenge at hand, not yet successfully overcome by single cutting-edge techniques. The coupling of such techniques with chemometrics, more specifically with multivariate regression methods, could turn this situation upside down thanks to the development of age quantitation methodologies based on the modelling of the modifications experienced by the evidence in its properties with respect to time. The potential applicability of these chemometric tools, however, remains poorly understood and underexploited due to their recent introduction into forensic dating research and the statistical background required for their optimal application. That is why this thesis focuses on highlighting the usefulness of multivariate regression methods in several forensic fields, such as questioned documents, art forgery and medico-legal death investigation, through the development and validation of dating methodologies in which non-destructive and micro-destructive techniques are applied together with the (orthogonal) partial least squares regression ((O)PLSR) method.

Los procesos de regeneración urbana pueden ser cruciales para lograr la transición hacia un nuevo modelo de desarrollo que dote a las ciudades de la suficiente complejidad, vitalidad y eficacia para hacer frente a las dinámicas segregativas y las injusticias sociales actuales. No obstante, para ello es preciso que dichos procesos se entiendan como transformaciones urbanas integrales e integradoras que hagan posible la inserción de las áreas vulnerables y de sus habitantes en el sistema urbano al que pertenecen. Esta premisa se ha ido incorporando al discurso entorno a la regeneración urbana a lo largo de más de tres décadas de andadura de las políticas públicas de este ámbito, sin embargo, esta evolución no se ha visto reflejada de manera directa en su implementación. A través de la investigación realizada se ha constatado la debilidad y la ambigüedad del discurso político en esta materia: contiene la complejidad de los planteamientos teóricos que se vienen desarrollando a escala europea pero carece de voluntad política y de instrumentos para llevarlos a cabo. A su vez, el estudio de los planes y programas impulsados por el Gobierno Vasco, ha permitido verificar que las divergencias existentes entre los objetivos estratégicos y su aplicación a escala local han aumentado y la incidencia de los programas en las áreas más vulnerables ha disminuido a medida que se han ido complejizando las propuestas teóricas.

It is known that invasive fungal infections have become a concern around the world due to the morbidity and mortality shown. The main responsible of these infections are aspergillus, cryptococcus and candida genus. However, candida has gained the attention of specialists due to the mortality shown in some population groups, where it can arrived to 40 %. Invasive candidiasis is treated with four antifungal drug families: azoles, polyenes, pirimidine analogues and echinocandins. Because of their use, fungi have developed different resistance mechanisms to ensure their proliferation even in presence of the drugs. As resistance mechanisms to echinocandin family remain, low specialists use them as a first-line therapy for invasive candidiasis. Unfortunately, in the last decade resistance of C. glabrata species to echinocandins has risen, especially to caspofungin (CSF). In this context, this work presents a deep sight of how to work with CSF in in vitro studies. First, an analytical methodology for the quantification of CSF in RPMI-1640 cell culture media has been developed and validated successfully. Secondly, the attempt of studying C. glabrata¿s resistance to CSF has been done, by means of two compartment pharmacokinetic/pharmacodynamic in vitro model. Finally, a stability study of CSF has been carried out checking degradation and adsorption possibilities. Results obtained shown the difficulties of working with CSF in human body conditions (pH around 7 and in aqueous solution) due to the adsorption phenomenon. This research provides a new perspective to assess the results obtained previously in microbiological and therapeutic fields and, supports researchers to go deeper in the evaluation of the reliability of the methodologies used for resistance determination and drug administration.

El sector agroalimentario es de gran importancia para la economía europea. La nueva política europea en reproducción animal está marcando una tendencia hacia sistemas de producción sostenibles utilizando recursos genéticos animales de origen autóctono. Por otro lado, el estudio de la variabilidad genética en raza bovinas, en relación con características de la calidad de la carne ha supuesto un paso necesario hacia la selección asistida por marcadores. Esta Tesis Doctoral tiene como objetivos: (1) la caracterización genética de varias razas bovinas bien establecidas en el País Vasco para el estudio de la diversidad genética, estructura poblacional, efecto fundador, alelos asociados a migraciones históricas, asignaciones genéticas, y estudio de las relaciones filogenéticas con otras razas bovinas europeas; y (2) caracterizar la composición de ácidos grasos del tejido adiposo de diferentes tipos comerciales bovinos producidos en el País Vasco con la intención de asociar este perfil de ácidos grasos a la expresión génica de varios genes y a polimorfismos de genes lipogénicos. En conclusión, los resultados confirman que las herramientas genéticas investigadas son útiles para estudiar con precisión el parentesco biológico, la identificación individual y controlar la trazabilidad en la industria alimentaria. Además, el enfoque genético desarrollado para el estudio de los genes (SCD1, SCD5 y SREBP1) relacionados con la homeostasis y el metabolismo de los lípidos, combinado con el análisis del perfil de ácidos grasos, contribuye a la comprensión de los caracteres asociados a la calidad de la carne. Este conocimiento es relevante para su uso en nuevas estrategias de selección, reproducción y una gestión sostenible con el objetivo de producir carne y productos derivados de alta calidad, como demandan las recomendaciones sanitarias actuales.

La aparición de nuevos conocimientos y tecnologías en microfabricación han permitido el desarrollo de nuevas herramientas miniaturizadas para ensayos de biología celular. El mayor progreso que estos dispositivos ofrecen es proveer a los investigadores con recursos para ensayos analíticos, útiles para un amplio rango de aplicaciones que pueden llegar a superar los métodos establecidos en términos de sensibilidad y rentabilidad. En la presente tesis, se han aprovechado algunas de estas microtecnologías para el desarrollo de plataformas biosensóricas simples pero versátiles y fiables, para su implementación en ensayos de alta relevancia biomédica. Concretamente, se han desarrollado dos tipos de biosensores. En primer lugar, se crearon biosensores para ensayos biomédicos de afinidad celular y citotoxicidad, basados en la adhesión de células a patrones de biomoléculas, sin y con integración en dispositivos microfluídicos. En segundo lugar, biosensores plasmónicos basados en fibras ópticas y nanopartículas de oro se desarrollaron y usaron para cuantificar agentes bioactivos como los iones de cobre y la proteína Citocromo c. Estos biosensores constituyen un paso adelante en un campo en auge que está llamado a cerrar la brecha entre la obtención de resultados cuantitativos y reproducibles y la democratización de los medios para obtener dichos resultados.

Como consecuencia de los cambios climáticos ocurridos durante las últimas décadas se prevé una intensificación de las temperaturas y de los periodos de sequía en muchas regiones vitivinícolas, donde Vitis vinífera esta sufriendo desajustes en sus ciclos reproductivo y vegetativo, así como en su fisiológica y metabolismo llegando a un debilitamiento del rendimiento y la calidad de los frutos producidos. Por este motivo, la zona vitivinícola de La Rioja requiere el emplear de nuevas técnicas agrícolas más respetuosas con el medio ambiente que mejoren la tolerancia de las plantas a estas condiciones adversas. En este contexto, el uso de bioestimulantes para minimizar los impactos del estrés hídrico puede ser una técnica prometedora, pero su mecanismo de acción es todavía desconocido en muchos casos. En esta tesis se estudió el mecanismo de acción de determinados bioestimulantes mediante el estudio de cambios morfo-fisiológicos, bioquímicos, y de producción que inducen en una plantación de Vitis vinífera (var. Tempranillo) poco productiva debido al escenario del cambio climático ubicada en La Rioja, y se comparó con un estudio llevado a cabo en la planta modelo Arabidopsis thaliana cultivada bajo déficit hídrico en condiciones controladas. En Vitis vinifera se desarrolló un plan de campo experimental definido por la aplicación foliar de tres productos bioestimulantes comerciales, basados en extractos de algas marinas y aminoácidos vegetales para determinar su mecanismo de acción a través de su perfil fisiológico y bioquímico. Se cuantificaron metabolitos como carbohidratos, ácidos orgánicos y aminoácidos en diferentes tejidos vegetales a través de cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) acoplada a diferentes detectores para obtener la mayor sensibilidad y la menor incertidumbre en la medida. Igualmente, en Arabidopsis tratadas con los mismo bioestimulantes se llevó a cabo un fenotipado de alto rendimiento de rasgos múltiples (MTHTSM) y estudio metabólico para evaluar la traducción biológica entre ambas plantas cultivadas en condiciones de déficit hídrico.

La presente Tesis Doctoral ha tratado de evaluar el efecto de los procesos de flujo génico y el impacto de la deriva sobre la diversidad genética de una población romaní residente en el País Vasco, por medio de una serie de análisis de un grupo de marcadores SNPs de ascendencia o de ancestría (AIMs), y un segundo grupo de inserciones Alu. Además, se han analizado otro grupo de poblaciones romanies europeas a partir de una serie de bases de datos de marcadores de linaje y STRs pertenecientes al sistema CODIS. Los resultados muestran que la población romaní de estudio, durante su diáspora, ha debido estar sujeta a períodos de aislamiento y tamaños efectivos reducidos, como consecuencia de efectos fundadores y cuellos de botella sucesivos, que han podido propiciar la acción de la deriva genética. Asimismo, se ha observado un notable impacto de flujo génico procedente tanto de su población huésped como de otras europeas y, eventualmente, del Próximo Oriente. Respecto a las poblaciones romaní europeas, analizadas tanto con STRs como con haplogrupos de ambos linajes, hemos observado una gran heterogeneidad en agentes microevolutivos estudiados siendo indicio de una subestructuración posterior a su entrada en el continente europeo. También se ha observado un mestizaje diferencial por sexos en las poblaciones romaníes europeas analizadas, con mayores indicios de mestizaje en los marcadores del linaje femenino respecto al masculino posiblemente siendo debido por la estructura jerárquica entre ambos sexos propia de esta etnia. Por último, ambos linajes muestran resultados dispares en respecto al origen de la etnia, para los haplogrupos del cromosoma Y el origen se localizaría en el sur de la India frente a los del ADNmt que indicarían que se encuentra en la región del Punjab al norte. Estos resultados indicarían o un evento de cuello de botella o de efecto fundador, en las poblaciones indias, posterior al inicio de la diáspora romaní. Otra posible explicación podría ser que el origen del linaje masculino radica en un grupo aún no identificado.

Vespa velutina (Lepeletier, 1836) o más conocida como avispón asiático es una especie invasora que entró en Francia por error en 2004 y se ha ido expandiendo por todo el continente europeo. Debido a su presencia fuera de su hábitat natural ocasiona graves daños a nivel económico y medioambiental, en destacando las grandes pérdidas en el sector apicultor la apicultura. Por ello, se han desarrollado diversos métodos de control para combatirla, que incluyen desde el trampeo de los avispones con atrayentes hasta la eliminación de los nidos mediante el uso de pértigas con biocida. En esta tesis doctoral se han realizado estudios de cautividad de esta especie invasora con el fin de ampliar el conocimiento sobre este avispón y mejorar las estrategias para combatirlo. Así mismo, se han obtenido los perfiles de compuestos volátiles de uno de sus métodos de control, cebos proteicos con el biocida fipronil, con el objetivo de conocer los marcadores de rechazo de esta especie hacia los cebos. Se ha estudiado la comunicación de los avispones con su colonia mediante uso de técnicas quimiométricas aplicadas al perfil de volátiles obtenido mediante GC-MS, en avispones y nidos. Además, se ha comprobado la eficacia de estos cebos en colmenares y en larvas alimentadas con los cebos proteicos con biocida en ensayos in vivo. A su vez, se ha desarrollado un método mediante HPLC-DAD

Esta tesis investiga diferentes aspectos de la manipulación de biofluidos complejos, como son el sudor, la sangre y el semen a microescala, para mejorar los enfoques de detección, separación y selección en dispositivos microfluídicos. Esto implica la fabricación de materiales sensores basados en alginato, así como su integración en diferentes plataformas microfluídicas para mejorar la detección de analitos. Además, también se investiga la generación de nuevas herramientas para la separación de plasma a partir de muestras de sangre humana completa mediante tecnología de impresión 3D. Por último, también se contempla el diseño y fabricación de novedosas configuraciones de dispositivos microfluídicos para la selección de espermatozoides viables con fines reproductivos.

During the Spanish Civil War and the posterior dictatorship, a huge number of people disappeared during the war or in episodes of repression. A large number of victims remain unidentified. One of the main limitations of these analyses is the difficulty of obtaining informative STRs profiles from the remains, limiting the identification of missing persons. With this aim, this work focuses on multidisciplinary research to investigate the relationship between the factors (physical-chemical and biological) that influence the state of preservation (anthropological and genetic) in order to understand the influence of these factors and increase the number of identifications of victims in the context of the Spanish Civil War. For this purpose, we have collected and analyzed the physicochemical composition of the graves and performed the anthropological analysis. Subsequently, the autosomal and Y-chromosome STRs of the skeletal remains were analysed. Finally, we developed a predictive statistical model to determine the most influential variable in obtaining an informative profile of autosomal STRs (>12STRs).With this, it has been possible to demonstrate that, in addition to DNA concentration and inhibition, also organic matter influence in successfully obtaining an informative autosomal STRs profile from skeletal remains buried in mass graves of Spanish Civil War.

Cystic fibrosis is the most common autosomal recessive rare disease in Caucasian populations. Despite the wide variety of mutations, patients with same mutations may present different clinical symptoms. This variability has led to the study of severity modifying genes. In the present study, a set of 33 SNPs located in 19 genes previously identified as modulatory genes for the severity of CF have been studied in 106 CF patients from the north of the Iberian Peninsula and the Balearic Islands, their parents and health controls. The main objective of this doctoral thesis is to detect the presence of gene variants and to infer a possible interaction between genetics and the common symptomatology of the disease. To carry out this objective, we proceeded to perform the association analysis (ASs) of each individual SNP with the different symptomatologies of the disease. These ASs have also shown that SNPs related to a modulator effect on a given symptomatology, also show associations with other CF symptoms. Several of these associations had not been previously described, thus constituting new findings. Considering genetically linked SNPs, haplotypes ASs were also performed. This approach has scarcely been used in previous studies in this field. The combination of the transversality of the effects of modulator gene SNPs combined with the increased robustness of association results based on haplotypic analyses determined the interest in performing multigene association analyses. This novel approach based on multigene models has allowed us to identify and objectify the impact of risk/protection genotypes, as this strategy better fits the reality of the patients' genome. The study of the modifier genes seems be a useful tool to dig deep on the pathogeny and to identify new therapeutic targets.

Algunos de los principales metabolitos presentes en las microalgas heterotróficas son los ácidos grasos Omega-3 PUFA. Existen retos importantes en el establecimiento de procesos de producción económicamente viables a partir de las microalgas heterotróficas, incorporando fuentes de carbono alternativas a la glucosa. Se han seleccionado las especies de microalgas heterotróficas capaces de crecer empleando como fuente de carbono ácidos grasos y producir omega 3 y otros compuestos bioactivos. Se ha estudiado el efecto de la sustitución de glucosa por ácidos grasos volátiles sintéticos en el crecimiento de las microalgas y la producción de biomasa, caracterizando los compuestos activos presentes y evaluando la citotoxicidad. Finalmente se ha evaluado la obtención de extractos ricos en compuestos activos de naturaleza lipófila mediante la aplicación de UAE con solventes ¿GRAS¿ como proceso más sostenible y de aplicación en alimentación y nutracéutica.

Liquids form the biggest portion of this world and our body. Life grows in liquids in tiny scales and the microfluidics field tries to offer methods to study liquids in a similar scale. We see water droplets on different surfaces everywhere, thus one of the general questions we face: is it possible to move or manipulate a water droplet on a surface in the direction we wish. This work targets this question, and asks about how to move water droplets on a surface with another liquid, a synthesized magnetic liquid, in a robust and controllable way. This work shows how we can control the interaction between two liquids in order to move water droplets in a programmable manner, on a surface. Moreover, it presents a novel approach to use this magnetic liquid for micro-structuring surfaces, will be used for passive manipulation of water droplets by altering their interaction with the surface.

La presente Tesis Doctoral se basa en el desarrollo de tres nuevos sistemas de producción de PRP. El objetivo fue mejorar su contenido molecular, enriqueciendo, además de los factores de crecimiento plaquetarios como en el PRP convencional, también los extraplaquetarios. Así, el trabajo incluye el desarrollo del protocolo de los tres nuevos métodos de obtención de PRP, la caracterización celular y molecular del PRP resultante y el análisis de su bioactividad en cultivos celulares. La Tesis es de carácter internacional, ya que se ha realizado una estancia de investigación en la Universidad de Twente, donde se testó el nuevo PRP en un modelo de articulación osteoartrítica de rodilla en chip.

Infection with the SARS-CoV-2 coronavirus results in COVID 19 disease, which is widespread and has significant impacts on public health and the workforce. The quest for indicators that can identify individuals with a heightened risk of SARS CoV 2 infection and the development of severe COVID 19 symptoms offers valuable insights into those most vulnerable to the virus. In the present study, a group of 21 S NPs situated within six genes known for their association with susceptibility to viral infections, along with 14 SNPs within nine genes linked to the severity of viral diseases, were examined. This investigation involved 465 patients residing in the Basque Country who contracted SARS CoV 2 between March 2020 and July 2021, as well as 150 control individuals from the same region who remained uninfected. The main objective of this project is to identify genetic markers that can be used to evaluate the likelihood of contracting SARS-CoV-2 and the seriousness of COVID 19 in the population. To carry out this objective, we conducted association analyses (AS) for each individual SNP to assess their connection with both susceptibility to SARS CoV 2 infection and the severity of COVID 19 disease. These AS have revealed that SNPs previously linked to susceptibility to infection also exhibit associations with disease severity, and conversely. Notably, some of these associations had not been previously reported, marking them as novel discoveries in this research. Considering that multiple SNPs are genetically linked, we conducted AS of haplotypes as well. This approach has been relatively underutilized in previous research within this domain. Given the broad reaching effects of SNPs associated with susceptibility and/or severity, coupled with the heightened robustness of association results derived from haplotype analyses, it became compelling to undertake the inference of descriptive. This innovative approach, centred on constructing descriptive models, has enabled us to pinpoint the most influential factors related to susceptibility and severity within the analysed sample. Consequently, this study has unveiled the most significant markers for assessing susceptibility and/or severity in a pre-pandemic context. Consequently, the combined analysis of these markers would facilitate effective infection prevention measures and an accurate approach to managing the preventive care of individuals already infected.

Los riesgos asociados con la radiación ultravioleta (UV) han llevado al uso generalizado de filtros UV en productos cosméticos y de cuidado personal. Su impacto en el entorno acuático es motivo de preocupación, ya que pueden bioacumularse en la biota marina y afectar a los organismos acuáticos. Por lo tanto, es esencial el monitoreo ambiental y el desarrollo de métodos analíticos sensibles para la detección y cuantificación de filtros UV en el entorno acuático. El papel de la Química Analítica es esencial para implementar metodologías que permitan la determinación a nivel de traza de estos compuestos en matrices ambientales. Esta Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de metodologías sostenibles basadas en la química verde para la extracción, análisis y monitoreo de filtros UV en aguas de mar. La incorporación de nuevos solventes eutécticos profundos (DES) en los procesos de microextracción permiten que este trabajo ofrezca soluciones innovadoras para un análisis preciso y respetuoso con el medio ambiente de los filtros UV. Asimismo, esta investigación aborda el diseño de nuevos procesos de muestreo y preservación de aguas de mar de la costa de Bizkaia para el monitoreo ambiental de filtros UV, y la escalabilidad de los materiales diseñados para su aplicación industrial.