Antropogenética

Práctica L5. Electroforesis de calidad del ADN.

Preparación del gel.

Las muestras se desplazarán en un gel de agarosa al 1,5%.

1. Se pesan 1,12 g. de agarosa.
2. Se disuelven en 75 ml. de medio TBE (0,5X). Para ello se utiliza un microondas, ya que se disuelve con dificultad.
3. La disolución se deja enfriar unos 6 minutos.
4. Se centrifuga 5 segundos el colorante (Midori Green).
5. Se añaden a la agarosa 4 µl de Midori Green, para teñir las moléculas de ADN y poder verlas mediante iluminación ultravioleta.
6. Se prepara el soporte del gel con los peines en el contenedor, ajustando la tuerca para evitar la pérdida de agarosa.
7. Se vierte la agarosa en el soporte.

Preparación de la cubeta y las muestras.

1. Después de 20 minutos se habrá polimerizado el gel. Entonces se quitan los peines y se separa el soporte con el gel de su contenedor aflojando la tuerca.
2. Se deposita el gel con su soporte en la cubeta de electroforesis.
3. Se cubre por completo con medio TBE.
4. Se cargan las muestras, pipeteando 10 µl de cada muestra en un pocillo, con 2 µl de tampón de carga.

 

Electroforesis del gel.

1. Se coloca la tapa de la cubeta y se conectan los electrodos a la fuente de alimentación.
2. Las condiciones de elctroforesis son: 120 Voltios, 20 minutos.

Visualización y documentación.

1. Se para la fuente de alimentación.
2. Se desconecta la cubeta de la fuente.
3. Se levanta la taapa y se extrae el soporte con el gel.
4. Se deposita el gel en el transiluminador. Para su uso es preciso utilizar protección contra la luz ultravioleta.
5. Se fotografía el gel.

Anexo: Preparación de TBE

El TBE o Tris/Borato/EDTA es una solución tampón utilizada especialmente en electroforesis de ADN, ya que mantiene unas condiciones de pH adecuadas, facilita la solubilidad del ADN y evita su degradación. Contiene Tris base, ácido bórico y EDTA.
  
1. Preparación de EDTA 0,5 M: Se pesan 1,97 g de EDTA trisódica y se disuelven en 10 ml de agua ultrapura. Se disuelve muy mal, por lo que se utiliza el agitador a una temperatura elevada. Se tapa el vaso de pecipitados para que no se evapore. Se conservará en un tubo Falcon. Al cabo del tiempo vuelve a precipitar.
2. Preparación de TBE 10X: Se pesan 5,4 g de Tris base 0,9 M y 2,75 g de Acido bórico 0,9 M. Se disuelven en 30 ml de agua ultrapura. Se añaden 2 ml de EDTA 0,5 M pH 8. Entonces se ajusta el volumen a 50 ml con agua ultrapura. Se conserva en botella a temperatura ambiente.  

3. Preparación de TBE 0,5X: Se disuelven 50 ml de TBE 10X en 950 ml de agua ultrapura. Se conserva en botella a temperatura ambiente. Puede reutilizarse como tampón en electroforesis, pero no debe usarse reutilizado para hacer geles.

 
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@Jose A. Peña, 2013-2024 Universidad del País Vasco