Antropogenética

Práctica L2. Reacción en cadena de la polimerasa. Indel Map Tau.

Map Tau

En el cromosoma 17, en la región 17q21.31 hay media docena de genes implicados en varios síndromes caracterizados por demencia, retraso mental, dificultades para el aprendizaje y posiblemente también en el Alzheimer. Entre ellos, el más conocido es MAPT (microtubule-associated protein tau), del que se ha demostrado ya una cierta relación con alguna de dichas demencias.

El gen MAPT codifica para la proteína tau, que está presente en el sistema nervioso, incluyendo las células nerviosas del cerebro. Participa en el ensamblaje y estabilización de los microtúbulos, que contribuyen al mantenimiento de la forma de las células, participan en la división celular y son esenciales para el transporte de materiales entre células.


Figura 1. Ubicación de la región MAPT.

Se han detectado en esta región varias mutaciones, alguna de ellas polimórficas, entre las cuales la más importante es la existencia de un fragmento invertido de unos 900.000 pares de bases. Esta mutación origina dos tipos de cromosomas, con la variante original y la invertida, que se conocen como haplotipo H1 y haplotipo H2.


Figura 2. Imagen FISH de 2 cromosomas H1 (arriba) y H2 (debajo).

En principio, el haplotipo H2 aparece casi exclusivamente en europeos. De hecho, se ha especulado con la posibilidad de que H2 hubiese sido transmitido al hombre moderno por los neandertales.
Por comparación con otras especies, parece ser que H2 sería el haplotipo original del orden primates. Sin embargo, el haplotipo más frecuente en nuestra especie, quizá debido a algún proceso de deriva durante el proceso de especiación, parece haber sido desde el principio H1. H2 habría estado siempre presente, pero a bajas frecuencias. 
Es posible que debido a un efecto de la deriva en Próximo Oriente, en algún momento anterior a la entrada de los hombres del Neolítico en Europa, éstos hayan portado una sobrerrepresentación de H2, lo que habría generado sus altas frecuencias en este continente.

Figura 3. Distribución del haplotipo MAPT*H2.

Tabla 1. Frecuencias del haplotipo H2 en muestras de diferentes continentes.

Existe un marcador indel que que permite identificar ambos haplotipos. Es un fragmento de 238 pares de bases que aparece en el haplotipo H1, pero no en el H2.

En esta práctica se analizará dicho marcador mediante amplificación PCR y electroforesis en gel de agarosa, pudiendo obtenerse dos tipos de bandas, correspondiendo la más pequeña, de 246 nucleótidos al haplotipo H2 y la más grande, de 484 nucleótidos al haplotipo H1.

Preparación de la solución PCR.

1. Se rotula un tubo Eppendorf en el que se preparará la solución PCR para 12 muestras.

2. Se rotulan los 10 tubos PCR de 0,2 ml. en los que se llevarán a cabo las reacciones.

3. En cada tubo PCR de 0,2 ml. se añaden 2 µl de ADN.
4. En el tubo de 0,5 ml. se prepara la solución mix-PCR. Para ello, se añaden:

5. Agitar bien la solución.
6. Añadir 9 µl. de solución a cada tubo PCR de 0,2 ml.
7. Llevar rapidamente al termociclador.

Programación del termociclador.
El programa PCR es el siguiente:

Se disponen los tubos con las muestras en el termociclador y se ejecuta el programa PCR.
Una vez terminado el programa, se conservan los amplificados a 4ºC hasta su visualización.

Anexo: El equipo de agua ultrapura

En numerosos análisis de laboratorio, tanto de Biología molecular como de otras áreas, es preciso utilizar agua en la medida de lo posible libre de sólidos disueltos y suspendidos, ya que podrían interferir en diferentes procesos. Así, es necesario a menudo controlar el pH en diferentes reactivos, conocer exactamente la proporción de iones para la correcta realización de una electroforesis o eliminar el ADN de diferentes microorganismos que pudieran interferir en una PCR. Por ello se han desarrollado diferentes sistemas para la obtención de agua con un alto grado de pureza. La unidad de medida de la misma es el Megaohmio por centímetro. El método más habitual ha sido tradicionalmente la destilación. El agua se hierve en un alambique, haciendo pasar el vapor por un serpentín donde se enfría para que se condense, perdiendo así una parte de la materia que lleva en disolución. De esta forma se obtiene agua destilada, que presenta una resistividad de entre 0,02 y 1,00 megaohmios por centímetro.
Mediante la desionización se eliminan las sales ionizadas del agua. Para ello se utilizan cartuchos de resinas de intercambio iónico de fabricación especial que teóricamente pueden eliminar el 100% de las sales. Sin embargo, no se eliminan sino una pequeña parte de compuestos orgánicos, virus o bacterias. La resistividad en estos casos suele quedar entre 0,5 y 5 megaohmios por centímetro.
Mediante un equipo combinado de cartuchos con resinas de intercambio iónico mixtas (catiónicas e iónicas), de eliminación de sustancias orgánicas, y un filtro final de 0,2 µm, puede conseguirse un agua casi completamente libre de solutos, pirógenos, etc. En este caso, se considera agua ultrapura y puede presentar una resistividad de entre 10 y 18,3 megaohmios por centímetro.
En un laboratorio de Biología molecular, siempre que sea posible es preciso utilizar agua ultrapura de más de 18 megaohmios por centímetro, tanto para PCRs, electroforesis como preparación de reactivos.

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